DOI:10.3969/ j.issn.2095-6002.2016.03.004
中图分类号:TS255.1
不同品种龙眼果肉酚类物质的抗氧化活性比较
林耀盛1， 张名位1， 张瑞芬1， 郭栋梁2， 潘学文2， 魏振承1， 张雁1， 刘磊1， 唐小俊1， 邓媛元1， 池建伟1
| 【作者机构】 | 1广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所/农业部功能食品重点实验室/广东省农产品加工重点实验室； 2广东省农业科学院果树研究所 |
| 【分 类 号】 | TS255.1 |
| 【基 金】 | 国家自然科学基金资助项目(31301459) 广东省自然科学基金资助项目(2014A030313568) 广州市珠江科技新星专项项目(201506010028) 广东省科技计划项目(2014A070713013，2016B070701012) |
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不同品种龙眼果肉酚类物质的抗氧化活性比较
摘 要：为研究不同龙眼品种资源中酚类物质、黄酮类化合物含量及其抗氧化性差异，选取广东省农业科学院果树研究所龙眼资源圃的24个龙眼品种，分析其果肉中游离态和结合态总酚、总黄酮物质的含量，采用DPPH自由基清除能力、ABTS总抗氧化能力、FRAP抗氧化能力和氧自由基吸收能力ORAC四种不同方法评价其体外抗氧化能力差异；不同龙眼品种果肉总酚、总黄酮含量与DPPH、ABTS、FRAP、ORAC四种不同方法测定的抗氧化能力的变幅和变异系数较大，呈现出显著的基因型差异；不同品种龙眼果肉的多酚和黄酮的含量分别与ABTS自由基清除能力、FRAP和ORAC呈极显著（p＜0.01）正相关关系，而与DPPH自由基清除能力的EC50值呈极显著负相关关系（p＜0.01）。采用快速聚类法将24个不同品种的龙眼聚成多酚及总黄酮含量和抗氧化能力差异显著的三大群类。不同品种龙眼果肉游离态和结合态酚类物质含量与其抗氧化活性均呈显著正相关关系，提示酚类物质是龙眼果肉抗氧化活性的主要成分；酚类物质和黄酮类物质在龙眼果肉中主要以游离态存在，其中结合态平均占总酚含量的17.45%。
关键词：龙眼品种；酚类物质；总黄酮；抗氧化活性；相关性
龙眼（Dimocarpus longan Lour.）为无患子科龙眼属常绿果树，是一种药食兼用的滋补佳品，其果实营养丰富，成为倍受人们推崇的“果中圣品”。Bazzano等［1 -2］研究认为，龙眼的保健作用主要来源于其特有的生物活性物质及其抗氧化作用。龙眼中的多酚和黄酮类物质可保护机体细胞和组织免受活性氧和自由基攻击造成的损伤，起到延缓细胞老化和预防疾病的作用。长期以来，对龙眼的研究多集中在化学成分和理化性质等方面［3 -4］，而对其生物活性方面研究较少，研究并开发此类天然生物活性的物质具有非常重要的意义。龙眼果肉富含多酚、多糖、类黄酮等具有生物活性以及药理活性的有效成分［5 -6］。现代药理研究表明，多酚和黄酮物质均具有抗氧化［7］、抗肿瘤［8］、增强免疫力［9］、调节内分泌及神经系统［10 -11］等活性，并且抗氧化作用是其多种生理活性功能的重要机制之一。王玲等［12］对龙眼多糖抗氧化能力进行研究，发现当多糖质量浓度大于100 μg/ mL时，浓度与羟自由基清除能力存在量效关系，但是超氧阴离子自由基的清除作用不太明显。石俊等［13］研究了龙眼果肉干制过程前后的多酚含量、存在形式及单体酚的组成和其抗氧化能力的差异，经干燥后龙眼果肉游离酚含量、FRAP抗氧化值和DPPH抗氧化能力值均显著下降，结合酚含量及FRAP抗氧化值显著上升。植物中酚类物质呈现游离态和结合态两种不同的存在形式。Sun等［14］对11种常见普通水果的研究表明，其总多酚含量中平均含有大约24%的结合酚，因而，单纯用溶剂直接提取植物组织中可溶性酚类物质往往造成对其总酚含量的低估而不能全面评价酚类物质。一直以来，人们对龙眼果肉中酚类物质的报道主要集中在游离态而忽视对结合态酚类物质的研究，没有较全面地评价其存在特征。因此，为了充分利用龙眼资源，本研究选取24个华南地区主栽龙眼品种，对不同品种龙眼的体外抗氧化活性差异进行研究，试图筛选出抗氧化活性强、总酚和总黄酮含量高的龙眼品种，为揭示龙眼抗氧化作用的物质基础提供依据，为龙眼的精深加工和栽培品种的选育提供科学指导。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 龙眼品种资源
24个龙眼品种均采摘自广东省农科院果树研究所龙眼资源圃。龙眼品种包括:蜀冠、沙梨肉、驼背木、后壁埔、赐合种、鸡卵眼、公妈本、后巷车、东壁、沙梨木、龙优、石硖、红核、罗伞木、硬赤壳、早白露、福眼、巨龙、水涨、乌龙岭、普明庵、华露广眼、储良、油潭本，于2013年7—9月各品种成熟期进行采摘。
1.1.2 仪器与试剂
UV-2450型紫外分光光度计，日本岛津公司；N-1100型旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；Tecan Infinite M200型多功能酶标仪，瑞士Tecan科技有限公司；Folin -Ciocalteu试剂、没食子酸、儿茶素等试剂补充Trolox（水溶性维生素E）、DPPH（1，1-二苯基-2-苦基苯肼）、ABTS（2，2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐）购自美国Sigma公司，TPTZ（三吡啶三吖嗪）购自Johnson Matthey公司。
1.2 实验方法
1.2.1 龙眼果肉游离态酚类物质的提取
参考Zhang等［15 -16］的方法并稍作改进。准确称取100.0 g不同品种的龙眼果肉在搅拌机内搅拌3 min，加入经4℃预冷的丙酮溶液（龙眼果肉与提取剂80%丙酮的质量（g）与体积（mL）比例为1∶2），于冰浴中采用组织匀浆机均质3 min，在4℃下5 000 r/ min离心5 min。将果渣沉淀重复提取一次，合并两次上清液于45℃下旋转蒸至无水状态，蒸馏水定容至20 mL，分装后在- 80℃保存备用。每个品种独立重复3次。
1.2.2 龙眼果肉结合态酚类物质的提取
参考Sun等［14，16］的方法，并稍作改进。将1.2.1游离酚提取后的果渣沉淀物加入20 mL 4 mol/ L NaOH溶液，氮气保护下振荡水解1 h，浓盐酸中和至pH值为7.0后用乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯萃取相，在45℃下旋转蒸发至干，残余物用蒸馏水定容至10 mL，-80℃保存备用。
1.2.3 总酚含量的分析
参考Singleton等［17］的方法测定。将制备的游离酚/结合酚提取液用蒸馏水稀释5～10倍，取0.5 mL蒸馏水和0.125 mL已稀释的样品溶液到试管中，加入0.125 mL Folin-Ciocalteu试剂，混匀。反应6 min后，依次加入7 g/ L的Na2CO3溶液1.25 mL和蒸馏水1 mL，混匀，25℃下避光反应90 min后，用紫外分光光度计在760 nm波长下测定其吸光值。同时以0.125 mL甲醇代替提取液作为空白对照，配置不同浓度梯度的没食子酸标准品，制作标准曲线。总酚含量结果以每100 g鲜果肉中所含的没食子酸质量表示，简写为mg/100 g。每个样品重复测定3次。
1.2.4 总黄酮含量分析
参考Dewanto等［18 -19］的方法并稍作改进。0.3 mL稀释后的游离酚/结合酚提取物加入1.5 mL蒸馏水和0.09 mL 5 g/ L的亚硝酸钠溶液。反应6 min后加入0.18 mL 10 g/ L的AlCl3·6H2O溶液，静置5 min后加入0.6 mL 1 mol/ L的NaOH溶液，最后用蒸馏水补足至3 mL，在510 nm下测定其吸光值。同时以0.3 mL甲醇代替提取液作为空白对照，配置不同浓度梯度的儿茶素标准品制作标准曲线。总黄酮含量结果以每100 g鲜果肉中所含的儿茶素质量表示，简写为mg/100 g。测定重复3次。
1.2.5 DPPH自由基清除能力测定
参考Zhang等［20 -21］的方法并稍作改进。200 μL提取物或甲醇溶液（参比溶液）加入2.8 mL 70 μmol/ L的DPPH甲醇溶液，振荡均匀后于暗室中反应30 min，于515 nm下测定其吸光值。样品的DPPH抗氧化能力表示为抑制率（I），计算公式见式（1）。式（1）中，Ac为参比甲醇实测吸光值，其范围控制为0.700±0.002，As为样品实测吸光值。同一样品稀释为6个不同浓度，分别测定其DPPH抗氧化能力，得到线性回归曲线并计算该样品半效应浓度EC50值（EC50表示DPPH自由基清除能力I为50%时所需要的龙眼果肉酚类物质提取物的质量浓度，单位为mg/ mL）。测定重复3次。
1.2.6 ABTS自由基清除能力测定
采用Miller等［22］的方法并略加调整。7 mmol/ L 的ABTS+·与2.45 mmol/ L的过硫酸钾用去离子水定容至25 mL，混合液在暗室下反应12～16 h，形成ABTS+·自由基储备液。测定前，将上述混合液与无水乙醇按照体积比1∶50比例混合，稀释为工作液，在734 nm波长调吸光度为0.700±0.020，于30℃下保温备用。准确移取100 μL稀释后的提取液，与2 mL ABTS+·混匀，在30℃暗室中反应30 min，于734 nm波长下测定其吸光度。以Trolox（水溶性维生素E）代替样品制作标准曲线，得到回归方程: Y = -0.005 4X + 0.675 6（R2= 0.999 9）。ABTS抗氧化能力值以每100 g鲜果肉中所含的Trolox质量（mg/100 g）表示。测定重复3次。
1.2.7 FRAP抗氧化能力测定
参考Foroogh等［23］的方法并略加修改。工作液的配制:300 mmol·L-1的醋酸钠缓冲液（称取1.823 g无水醋酸钠和16 mL的冰乙酸，定容至1 L，pH值为3.6），10 mmol/ L的TPTZ（称取0.078 g TPTZ，溶剂为40 mmol/ L的盐酸溶液定容至25 mL），20 mmol/ L的FeCl3·6H2O（称取0.135 2 g FeCl3·6H2O定容至25 mL），按照体积比为10∶1∶1的比例混合；使用前于37℃水浴中加热10 min备用，避光现配现用。移取200 μL龙眼酚类物质提取液，加入2.80 mL工作液，混匀后暗室反应30 min，于593 nm波长下测定吸光值。以甲醇代替提取液作空白对照，Trolox为标准品绘制标准曲线。铁离子还原抗氧化能力值（ferric reducing antioxidant power，FRAP）以每100 g鲜果肉中所含的Trolox质量（mg/100 g）表示。测定重复3次。
1.2.8 ORAC抗氧化活性测定
参照Wolfe等［24］的方法。提取液用氮气吹干后再用75 mmol/ L磷酸缓冲液稀释至总酚含量在一定范围内，标准品稀释或样品等的溶解均使用75 mmol/ L磷酸钾缓冲液（pH = 7.4）。首先向空白孔中加入20 μL磷酸缓冲液，其余孔中分别加入20 μL不同浓度的Trolox标准溶液（6.25，12.50，25.00，50.00 μmol/ L）、样品溶液或17.5 μmol/ L的没食子酸溶液，另设加入40 μL磷酸盐缓冲液和200 μL荧光素钠工作液的F孔，各处理均设3个复孔。将96孔板放入荧光酶标仪中37℃孵育10 min；除F孔外，每孔加入200 μL 0.96 μmol/ L荧光素钠溶液，37℃孵育20 min；除F孔外，每孔再加入20 μL ABAP溶液（119 mmol/ L，临用前用缓冲液配制），立即启动荧光酶标仪，在37℃下以激发波长485 nm，发射波长538 nm连续测定各孔的荧光强度监测荧光衰退情况，每4.5 min重复测定一次，测定35个循环值。将酚类提取液的自由基作用下荧光衰退曲线的延缓部分面积（Net AUC）带入6.25，12.50，25.00 和50.00 μmol/ L标准抗氧化物质Trolox的Net AUC 与Trolox浓度所做标准曲线，得到各提取液的氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）值，以每100 g样品中所含Trolox质量（μmol/100 g）表示，实验重复3次。
1.3 统计分析
以24个不同龙眼品种果肉游离态和结合态酚类物质含量、黄酮类物质含量、DPPH自由基清除能力、ABTS清除活性、FRAP、ORAC为变量标准化后，采用系统聚类法进行聚类分析；各变量之间相关性采用Pearson相关性分析。
2 结果与分析
2.1 不同龙眼品种果肉总酚及总黄酮含量分布情况
24个品种龙眼果肉中游离和结合态总酚、总黄酮含量及变幅和变异系数结果见表1。24个不同品种龙眼果肉中游离酚含量的变幅为16.92～109.24 mg/100 g，平均值为62.29 mg/100 g，变异系数为43.55%，表明品种差异较大；结合态多酚含量变幅为3.67～23.30 mg/100 g，平均值为13.04 mg/100 g，变异系数为42.50%；总酚含量的变幅为22.09～132.47 mg/100 g，平均值为75.53 mg/100 g，变异系数为43.70%。不同龙眼品种果肉中酚类物质以游离态为主，占总酚含量的76.50%～87.00%。
由表1可见，24个不同品种龙眼果肉中游离态黄酮含量的变幅为2.26～13.4 mg/100 g，平均值为6.59 mg/100 g，变异系数为45.18%，表明品种差异较大；结合态黄酮含量变幅为0.14～0.86 mg/100 g，平均值为0.42 mg/100 g，变异系数为51.89%；总黄酮含量的变幅为2.48～14.26 mg/100 g，平均值为7.01 mg/100 g，变异系数为45.31%。不同龙眼品种果肉中黄酮物质以游离态为主，占总黄酮含量的89.9%～95.0%。
表1 不同品种龙眼果肉总酚和总黄酮含量的变幅和变异系数
Tab.1 Ranges and CVs of total phenolic and flavonoid contents of fruit pulp from different longan varieties mg·100 g-1
*括号中数值表示占总值的百分比
2.26～13.40 0.14～0.86 2.48～14.26 w（总黄酮） 均值 6.59±2.98（94.01）* 0.42±0.22（5.99） 7.01±3.18（100.00）变异系数16.89～109.17 5.20～23.30 22.09～132.47 w（总酚） 均值 62.29±27.10（82.47）* 13.25±6.13（17.54） 75.53±33.01（100.00）变异系数CV/% 43.51 46.30 43.70变幅类型 指标 游离态 结合态 总质量比变幅CV/% 45.18 51.89 45.31
2.2 不同龙眼品种果肉体外抗氧化活性分析
24个不同品种龙眼果肉中酚类物质DPPH自由基清除能力结果见表2。DDPH清除能力大小用EC50值表示，该值越高，表明样品清除自由基能力越弱。从表2结果看出，不同龙眼品种间清除DPPH自由基能力存在显著差异。游离部分EC50值变幅为9.66～156.98 mg/ mL，平均值为53.63 g/ L，变异系数为95.58%；结合部分EC50值变幅范围为57.92～928.15 g/ L（p＜0.05），平均值为255.84 g/ L，变异系数为95.27%，表明各品种间差异较大。总体而言，龙眼果肉游离部DPPH自由基清除能力强于结合部。
不同品种龙眼果肉中游离和结合态酚类提取物ABTS自由基清除能力结果见表3。游离部分ABTS自由基清除能力值变幅为108.61～336.62 mg/100 g，变异系数为35.33%，平均为211.99 mg/100 g；结合态清除能力值变幅为13.14～80.71 mg/100 g，平均为45.03 mg/100 g。不同品种龙眼果肉游离部分和结合部分清除ABTS自由基能力总和的变幅为134.73～447.33 mg/100 g，平均为257.02 mg/100 g，变异系数为36.70%。
表2 不同品种龙眼果肉酚类物质的DPPH自由基清除能力
Tab.2 DPPH radical scavenging capacity of free and bound forms of phenolic extracts from longan pulp of different varieties
）品种EC50/（mg·mL-1游离态 结合态早白露9.66±1.11 s 65.24±0.95 s油潭本 13.65±1.13 qr 84.88±1.38 q硬赤壳 130.41±2.23 c 928.15±1.37 a乌龙岭 10.31±0.15 s 57.92±0.58 t驼背木 55.35±2.25 i 236.36±0.35 i水涨 200.15±1.30 a 597.78±3.15 c蜀冠 20.18±0.17 o 119.18±2.05 l石硖 14.69±0.06pq 80.80±1.26 r沙梨肉 89.29±1.32 e 452.41±1.43 e沙梨木 29.73±1.32 k 130.32±1.10 k普明庵 25.23±0.16 m 108.05±1.72 m罗伞木 16.23±0.36 p 90.10±0.34 p龙优 55.02±1.41 i 232.54±0.17 j巨龙 73.26±1.31 f 412.42±1.38 f鸡卵眼65.16±0.26 g 288.59±1.93 g
续表2
不同小写字母表示数值间有显著差异（p＜0.05）
）品种EC50/（mg·mL-1游离态 结合态华露广眼156.98±2.00 b 771.50±2.15 b后巷车 63.08±1.21 h 270.82±3.56 h后壁埔 12.42±0.14 r 68.28±1.10 s红核 23.18±0.42 n 103.34±2.05 n公妈本 27.72±1.18 l 122.20±3.87 l福眼 20.27±0.23 o 95.23±1.89 o东壁 19.11±0.44 o 108.64±2.86 m赐合种 116.04±1.38 d 584.48±4.46 d储良39.92±1.23 j 131.01±2.61 k
不同品种龙眼果肉中游离态和结合态酚类提取物FRAP抗氧化能力结果见表4，游离态FRAP抗氧化能力变幅为55.80～334.98 mg/100 g，变异系数为40.61%，平均为184.81 mg/100 g；结合态FRAP抗氧化能力值变幅为11.87～73.05 mg/100 g，平均为41.97 mg/100 g。不同品种龙眼果肉中总FRAP抗氧化能力的变幅为67.68～407.03 mg/100 g，平均为226.77 mg/100 g，变异系数为40.08%。
不同品种龙眼果肉游离和结合态酚类提取物ORAC抗氧化能力见表5，游离态的ORAC值变幅范围为1 410.78～5 728.89 mg/100 g，变异系数为36.99%，平均为3 244.96 mg/100 g；结合态ORAC值变幅为296.17～1 317.89 mg/100 g，平均为672.65 mg/100 g。不同品种龙眼果肉中总ORAC值的变幅为1 706.96～7 046.78 mg/100 g，平均为3 917.61 mg/100 g，变异系数为36.89%。
表3 不同品种龙眼果肉酚类物质的ABTS抗氧化能力
Tab.3 ABTS radical scavenging capacity of free and bound forms of phenolic extracts from longan pulp of different varieties
不同小写字母表示数值间有显著差异（p＜0.05），括号中数值表示占总值百分比
品种ABTS自由基清除能力值/（mg·100 g-1）游离态 结合态 总量早白露 366.62±7.81 a（81.96） 80.71±2.36 a（18.04）320.24±1.50 c 447.33±10.05 a油潭本 298.85±6.12 d（84.97） 52.84±3.39 cd（15.03） 351.70±9.33 cd硬赤壳 119.10±1.17 nop（82.30） 25.62±0.11 ijk（17.70） 144.73±1.28 klm乌龙岭 324.72±8.67 b（80.66） 77.85±3.54 a（19.34） 402.58±8.41 b驼背木 212.08±3.13 hi（86.47） 33.18±0.69 ghi（13.53） 245.26±3.41 g水涨 108.61±2.58 p（85.14） 18.96±1.28 kl（14.86） 127.57±3.58 m蜀冠 199.51±1.34 ij（80.31） 48.92±0.23 def（19.69） 248.42±1.42 g石硖 288.38±1.28 cd（78.40） 79.45±1.09 a（21.60） 367.82±0.74 c沙梨肉 131.45±0.96 mn（82.44） 27.99±0.06 hij（17.56） 159.44±0.98 ijk沙梨木 192.10±14.53 j（81.62） 43.25±3.34 f（18.38） 235.35±17.77 g普明庵 223.73±9.40 h（91.13） 21.77±2.21 jk（8.87） 245.50±7.70 g罗伞木 278.52±9.29 de（80.34） 68.14±3.03 b（19.66） 346.66±11.10 d龙优 168.80±8.67 k（82.28） 36.36±4.09 g（17.72） 205.16±11.48 h巨龙 144.57±13.03 lm（82.99） 29.62±1.95 ghi（17.01） 174.19±14.69 i鸡卵眼 153.98±8.03 kl（92.14） 13.14±2.76 l（7.86） 167.12±10.32 ij华露广眼 113.70±4.04 op（84.39） 21.03±0.32 ik（15.61） 134.73±4.24 lm后巷车 161.08±10.44 k（82.50） 34.18±2.90 gh（17.50） 195.26±12.14 h后壁埔 318.47±8.87 b（80.59） 76.68±1.60 a（19.41） 395.15±8.13 b红核 245.65±1.22 g（83.31） 49.21±0.89 def（16.69） 294.86±2.07 f公妈本 195.65±2.02 j（79.47） 50.55±9.31 cde（20.53） 246.20±8.78 g福眼 259.69±9.51 fg（82.08） 56.70±3.67 c（17.92） 316.39±12.74 e东壁 269.26±24.41 ef（80.38） 65.73±12.70 b（19.62） 334.99±34.60 d赐合种 127.75±6.11 no（83.62） 25.03±1.62 ijk（16.38） 152.78±7.68 jkl储良 185.62±1.93 j（80.94） 43.70±0.28 ef（19.06） 229.31±2.04 g早白露 333.98±5.17 a（82.05） 73.05±2.15 a（17.95） 407.03±4.98 a油潭本 263.68±1.20 d（82.34） 56.56±0.75 d（17.66）
表4 不同品种龙眼果肉酚类物质的FRAP抗氧化能力
Tab.4 FRAP of antioxidant activity in phenolics of different varieties longan pulp
不同小写字母表示数值间差异显著（p＜0.05），括号中数值表示占总值百分比
?
表5 不同品种龙眼果肉酚类物质的ORAC抗氧化能力
Tab.5 ORAC of antioxidant activity of phenolic extracts of fruit pulp from different longan varieties
?
续表5
不同小写字母表示数值间差异显著（p＜0.05），括号中数值表示占总值百分比
品种ORAC值/（mg·100 g-1）游离 结合 总量罗伞木 4 282.46±34.05 f（82.35） 917.68±58.18 cd（17.65）3643.27±22.84 k 5200.14±85.67 d龙优 2 720.44±54.86 p（82.64） 571.32±23.48 h（17.36） 3291.76±61.43 m巨龙 2 066.91±19.99 s（80.40） 503.92±22.70 i（19.60） 2570.83±29.33 p鸡卵眼 2 358.71±35.04 r（83.25） 474.63±14.40 i（16.75） 2833.34±29.76 o华露广眼 1 565.84±56.75 v（81.23） 361.83±15.70 j（18.77） 1927.67±47.70 s后巷车 2 566.54±92.52 q（81.24） 592.82±40.68 gh（18.76） 3159.35±118.84 n后壁埔 4 683.65±7.91 c（84.03） 889.83±78.08 d（15.97） 5573.49±72.00 c红核 3 868.50±85.11 i（82.64） 812.48±5.30 e（17.36） 4680.98±79.83 g公妈本 3 104.94±53.03 m（79.81） 785.35±22.81 e（20.19） 3890.29±48.27 j福眼 3 941.51±14.72 h（82.64） 827.71±22.94 e（17.36） 4769.22±25.38 f东壁 4 098.46±16.64 g（83.82） 791.12±33.13 e（16.18） 4889.58±33.39 e赐合种 1 703.51±3.64 u（82.36） 364.83±15.70 j（17.64） 2068.33±12.27 r储良 3 010.97±23.50 n（82.64） 632.30±21.36 fg（17.36）
2.3 抗氧化能力与酚类物质含量的相关性分析
分别分析24个不同品种龙眼果肉中酚类物质含量及抗氧化能力等各变量间的相关关系，其相关系数见表6。总酚含量与DPPH自由基清除能力呈显著负相关，其中游离态、结合态的相关系数分别为-0.832（p＜0.01），-0.830（p＜0.01）；总酚含量与FRAP抗氧化能力呈显著正相关关系，其中游离态、结合态、总含量与FRAP抗氧化能力的相关系数分别为0.987（p＜0.01），0.958（p＜0.01），0.987 （p＜0.01）；总酚含量与ABTS抗氧化能力呈现显著正相关关系，其中游离态、结合态、总含量与ABTS抗氧化能力的相关系数分别为0.976（p＜0.01），0.927（p＜0.01），0.974（p＜0.01）；总酚含量与ORAC抗氧化能力亦呈现显著正相关关系，其中游离态、结合态、总含量与ORAC抗氧化能力的相关系数分别为0.992（p＜0.01），0.965（p＜0.01），0.989（p＜0.01）。
黄酮含量与DPPH抗氧化能力呈显著负相关关系，其中游离态、结合态黄酮与DPPH自由基清除能力的相关系数分别为-0.823（p＜0.01）和-0.737 （p＜0.01），而与FRAP和ABTS抗氧化能力均呈显著正相关。游离态、结合态、总黄酮含量与FRAP抗氧化能力的相关系数分别为0.827（p＜0.01），0.766（p＜0.01）和0.828（p＜0.01），与ABTS抗氧化能力的相关关系分别为0.882（p＜0.01），0.806（p＜0.01）和0.877（p＜0.01），与ORAC抗氧化能力的相关关系分别为0.864（p＜0.01），0.808（p＜0.01）和0.861（p＜0.01）。
表6 龙眼果肉酚类物质含量与抗氧化活性的相关性
Tab.6 Correlations between phenolics content of longan pulp and antioxidant activity
*表示差异达显著水平（p＜0.05），**表示差异达极显著水平（p＜0.01）
存在形式 相关性DPPH FRAP ABTS ORAC游离态 -0.832**0.987** 0.976** 0.99**总酚 结合态 -0.830**0.958** 0.927** 0.97**总含量 — 0.987** 0.974** 0.99**游离态 -0.823**0.827** 0.882** 0.86**总黄酮 结合态 -0.737**0.766** 0.806** 0.81**总含量 — 0.828** 0.877** 0.86**
2.4 不同龙眼品种果肉酚类含量及黄酮含量和抗氧化活性的聚类分析
对24个龙眼品种抗氧化活性指标进行聚类分析，对数据采用不转换方式，聚类距离采用欧式距离，聚类方法采用系统质心聚类法，数据处理采用SPSS19.0软件统计分析，结果见图1和表7。由图1可见，将24个龙眼品种聚成Ⅲ大类，其中，第Ⅰ大类由5个品种组成，第Ⅱ类由9个品种组成，第Ⅲ类由10个品种组成；由表7可以看出，第Ⅰ大类聚成的龙眼品种的游离酚、游离类黄酮含量和抗氧化活性均最高；第Ⅲ大类龙眼品种的游离酚含量和抗氧化活性在三大类中属于中间水平，而其黄酮含量最高，与第Ⅰ大类中黄酮含量比较差异不显著；第Ⅱ大类龙眼品种的游离酚、黄酮类等含量和抗氧化活性均在这三大类中含量最低。
表7 聚类分析聚成的三类龙眼品种其果肉酚类及黄酮类物质含量和抗氧化能力差异比较
Tab.7 Different comparison of phenolics and flavonoid content and antioxidant capacity with three broad categories on different types of longan pulp mg·100 g-1
不同小写字母表示同一行数据差异达显著性水平（p＜0.05），括号中数值表示占总值的百分比
类型 Ⅰ类 Ⅱ类 Ⅲ类w（游离酚） 97.15±9.15（47.30）a 35.04±12.53（17.06）c 73.20±8.48（35.64）b w（结合酚） 19.96±2.34（45.99）a 7.15±2.38（16.47）c 16.29±3.77（37.53）b w（总酚） 117.11±11.16（47.07）a 42.19±14.76（16.96）c 89.49±11.64（35.97）b w（游离黄酮） 7.08±1.04（46.83）b 0.48±0.16（3.17）c 7.56±1.14（50.00）a w（结合黄酮） 4.09±1.97（47.23）b 0.24±0.15（2.77）c 4.33±2.11（50.00）a w（总黄酮） 10.73±1.58（47.10）b 0.66±0.12（2.90）c 11.39±1.69（50.00）a游离态DPPH清除能力EC50值/（mg·mL-1） 12.15±2.14（8.85）c 100.47±98.61（73.21）a 24.62±7.17（17.94）b结合态DPPH清除能力EC50值/（mg·mL-1） 71.43±11.17（10.81）c 477.50±479.29（72.25）a 112.01±14.64（16.95）b游离态ABTS清除能力 319.41±30.18（46.20）a 144.11±31.36（20.85）c 227.75±36.28（32.95）b结合态ABTS清除能力 73.51±11.65（49.08）a 26.51±7.31（17.70）c 49.77±13.72（32.22）b 总ABTS清除能力 392.92±36.70（46.72）a 170.62±35.98（20.28）c 277.52±45.89（33.00）b游离态FRAP 289.68±35.66（47.58）a 114.59±36.25（18.82）c 204.56±24.56（33.60）b结合态FRAP 65.31±9.07（47.30）a 25.68±7.75（18.60）c 47.10±5.99（34.10）b 总FRAP 204.56±24.56（34.29）b 140.27±43.19（23.52）c 251.66±24.08（42.19）a游离ORAC 4 886.20±515.12（46.13）a 2 092.60±512.68（19.76）c 3 613.55±466.33（34.11）b结合态ORAC 999.47±191.66（45.67）a 445.23±118.76（20.34）c 743.77±107.74（33.99）b 总ORAC 5 885.67±702.83（46.05）a 2 537.84±626.50（19.86）c 4 357.32±545.19（34.09）b
图1 不同龙眼品种果肉聚类分析图
Fig.1 Clustering results of different varieties of longan pulp
3 讨 论
3.1 不同抗氧化活性评价方法的差异
大量研究发现，水果蔬菜中丰富的多酚、多糖和膳食纤维等活性物质在防治人体慢性疾病中发挥了重要作用。来自蔬菜、水果等的酚类物质是清除体内自由基的重要物质基础，虽然测定抗氧化能力的方法很多，但由于测定样品的复杂性以及反应体系机制的多样性，目前还缺乏一种标准的方法全面评价植物提取物的抗氧化能力。Frankel［25］指出，只采用一种方法来评价抗氧化剂的活性是不科学的，难以全面体现不同龙眼品种抗氧化作用的差异性。目前对水果、蔬菜的抗氧化活性的评价多数采用的是清除自由基抗氧化能力的方法，主要包括有DPPH自由基清除能力、ABTS总抗氧化能力、FRAP抗氧化能力和氧自由基吸收能力ORAC等方法。本实验采用这4种方法测定不同品种龙眼果肉酚类物质的抗氧化能力，结果具有很高的重现性，4种方法虽然数值上表示不同，但是其活性物质抗氧化能力的强弱大体是一致的。DPPH、FRAP和ORAC三种方法测定所需的工作液，避光现配现用，而ABTS工作液则需要在暗室下反应12～16 h，ABTS需经活性氧氧化后，生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS+·储备液后才可以使用。从实验成本上看，ORAC法测定采用多功能酶标仪，而其他3种测定方法仅需要普通的分光光度计，相比之下，ORAC法所用的成本会昂贵些，但是其精密度和重现性更好。
3.2 不同龙眼品种的抗氧化活性的差异
本研究结果显示，24个不同品种龙眼果肉中总酚的含量变幅为20.57～132.55 mg/100 g，平均为75.32 mg/100 g，不同品种龙眼果肉酚类物质含量及其抗氧化能力差异显著。植物中酚类物质含量及其抗氧化活性差异，一方面受到地域差异如外在生长环境、气候、土壤肥沃程度以及种植技术等的影响，基因型的差异是造成这种差别的另一方面重要原因。本研究所采集的龙眼样本均来自于同一种质资源圃，其生长环境和种植方法基本一致。因此，可以判断，这种品种间的差别主要是由其基因型差异造成的。主栽品种龙眼（如早白露、乌龙岭、后壁埔、石硖、储良等品种）比其他少栽品种龙眼（硬赤壳、赐合种、后巷车、水涨）抗氧化能力高，这也是符合优胜劣汰的自然选择规律，同时也是品种的基因遗传长期积累的结果。
3.3 不同龙眼品种果肉酚类物质的含量与抗氧化能力相关性
酚类物质是植物重要的次级代谢产物，对植物的品质、色泽、风味等有一定的影响，同时还具有抗氧化、抗癌、抗逆等重要作用，能有效清除体内过剩的自由基，抑制脂质过氧化，对自由基诱发的生物大分子损伤起到保护作用［26 -27］。富含酚类物质的食物对防止冠心病、预防癌症具有重要意义，使得国内外对酚类物质的研究十分活跃。
本研究结果表明，不同品种龙眼果肉的DPPH自由基清除能力的EC50值分别与其多酚、黄酮含量呈现显著的负相关性（p＜0.05），与FRAP值、ABTS值和ORAC值呈现极显著的正相关性（p＜0.01）。DPPH的EC50值越小，说明物质抗氧化能力越强，因此说明，运用DPPH、FRAP、ABTS和ORAC四种不同的抗氧化评价方法测定的龙眼果肉抗氧化活性与其酚类物质含量具有显著的正相关关系，提示酚类物质是龙眼果肉中抗氧化活性的重要物质基础。目前常用的多酚类物质的制备方法得到的仅仅是游离酚部分，在抗氧化活性和含量的研究过程中均没有把结合态多酚考虑在内，这就大大低估了各种植物中多酚的含量及其活性。本研究显示，24个不同品种龙眼果肉结合态酚含量高达13.21 mg/100 g，占总酚含量约17.45%，而Sun等［14］对11种常见普通水果的研究表明其总多酚含量中平均含有大约24%的结合酚。因而，单纯用溶剂直接提取植物组织中可溶性酚类物质，往往造成对其总酚含量的低估，而不能全面的评价酚类物质，这与本文研究结果结论基本一致。这些结合态的活性组成，主要是β-糖苷结合物，因不能被人体内的消化酶消化而能存在于肠胃消化系统，甚至可以到达结肠部位。有学者推测，这些结合态酚类组分可能通过肠道微生物菌群的酵解作用破坏其共价键，促进酚类物质释放出来，从而发挥健康作用［28 -29］，可见结合酚也是龙眼果肉重要的生物活性成分。
本研究结果表明，不仅游离态酚类物质含量与其抗氧化活性间存在显著相关性，结合态酚类物质也同样存在相关性。不同品种龙眼果肉中抗氧化能力随着酚类物质的含量的变化而呈现显著性，可见酚类物质含量是抗氧化能力强弱一个重要的表征。
4 结 论
不同品种龙眼果肉游离态和结合态酚类物质含量与其抗氧化活性均呈显著正相关关系，提示酚类物质是龙眼果肉抗氧化活性的主要成分；酚类物质和黄酮类物质在龙眼果肉中主要以游离态存在，其中结合态占总酚含量的17.45%。将24个龙眼品种聚成Ⅲ类，第Ⅰ类酚类物质及黄酮类物质的含量和抗氧化活性最高，而第Ⅲ类则最低。
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Comparison of Phenolic Contents and Antioxidant Activity of Fruit Pulp from Different Longan Varieties
Abstract: The correlation of the in vitro antioxidant activity with contents of total phenol and flavonoid in fruit pulp of 24 longan varieties was analyzed.The contents of free and bound phenolics，total flavonoids and total phenol in 24 varieties of longan pulp from Institute of Pomology of Guangdong Academy of Agricultural Sciences were investigated.The radical scavenging ability（DPPH），total antioxidant capacity （ABTS），antioxidant capacity（FRAP），and absorptive capacity of oxygen free radicals（ORAC）were determined for evaluating their in vitro antioxidant capacity difference.The total polyphenols，flavonoids，DPPH，FRAP，ABTS and ORAC methods were used to determine the antioxidant abilities of phenolic extracts of different longan pulp varieties.Results showed that a significant difference（p＜0.01）existed in the capacity of pulp phenolic extracts of different longan varieties and displayed significant genotype differences.The longan varieties with the higher content polyphenol and flavone showed stronger antioxidant activity.The quick clustering method was used to evaluate polyphenols and flavonoids content and antioxidant capacity in 24 varieties of longan pulp，dividing into three group of classes with significant difference.The polyphenols or flavonoids content positively correlated with the ABTS，FRAP，and ORAC analysis while it negatively related with the DPPH radical scavenging capacity（p＜0.01）.Thus，phenolics and flavonoids exist mainly in the free form in longan pulp.Phenolics of longan pulp had played an important role in antioxidant activity.
Key words: longan variety；phenolic contents；total flavonoid；antioxidant activity；correlation
（责任编辑:叶红波）
中图分类号：TS255.1；TS201.2
文献标志码：A
doi:10.3969/ j.issn.2095-6002.2016.03.004
文章编号：2095-6002（2016）03-0020-11
引用格式：林耀盛，张名位，张瑞芬，等.不同品种龙眼果肉酚类物质的抗氧化活性比较［J］.食品科学技术学报，2016，34（3）: 20 -30.
LIN Yaosheng，ZHANG Mingwei，ZHANG Ruifen，et al.Comparison of phenolic contents and antioxidant activity of fruit pulp from different longan varieties［J］.Journal of Food Science and Technology，2016，34（3）:20 -30.
收稿日期:2016- 05- 10
基金项目:国家自然科学基金资助项目（31301459）；广东省自然科学基金资助项目（2014A030313568）；广州市珠江科技新星专项项目（201506010028）；广东省科技计划项目（2014A070713013，2016B070701012）。
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