作为一种自然界天然存在但含量极少的糖，D-阿洛酮糖属于一种新型低热量甜味剂，其甜度相当蔗糖的70%，能量仅为蔗糖的0.3%[1-2]，D-阿洛酮糖还具有特殊的生理活性，包括预防肥胖[2-3]、降血糖[3-4]、降血脂[5]、抗氧化[4]、保护神经[6]以及抑制癌细胞[7]等，因此，D-阿洛酮糖在降低糖吸收、调控身体机能以及抑制癌细胞等领域具有重要的应用价值，市场潜力广阔。

D-阿洛酮糖是D-果糖在C3位置的差向异构体，目前，主要采用化学合成和生物合成技术实现D-阿洛酮糖的生产。采用化学合成技术，钼酸盐在80～120 ℃能够将葡萄糖转化为D-阿洛酮糖[8]；生物合成主要是通过D-塔格糖差向异构家族酶催化生成D-阿洛酮糖，与化学方法相比较，生物催化合成更为环保，分离纯化难度更小。通过基因工程技术，催化产D-阿洛酮糖的D-塔格糖差向异构家族酶已在大肠杆菌[9]、枯草芽孢杆菌[10]和酿酒酵母[11]中实现高效表达，基因来源主要为梭状芽孢杆菌[12-13]，瘤胃球菌[9]，根癌土壤杆菌[14-15]，球形红菌[16]，密螺旋体属菌[17]等。在国内，江南大学采用通过D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因克隆、工程菌构建和发酵控制等技术，将D-果糖转化为D-阿洛酮糖[17-18]。目前，全球D-阿洛酮糖的主要生产商韩国希杰第一制糖株式会社、英国泰莱和日本松谷集团都采用生物方法，将D-果糖转化为D-阿洛酮糖。因此，构建可催化产D-阿洛酮糖的基因工程菌是实现D-阿洛酮糖产业化的重要途径。

本研究根据NCBI公布的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(DPEase)基因的全序列，设计引物，扩增DPEase基因，通过生物信息学软件分析基因序列，预测翻译后的蛋白质结构和性质；构建原核重组质粒，检测DPEase基因在E.coli BL21中诱导表达，为进一步构建DPEase基因工程菌提供材料。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105由唐晓凤博士馈赠，保存于合肥工业大学农产品精深加工实验室；E.coli DH5α、E.coli BL 21感受态细胞、Fast PfuDNA聚合酶、pEASY-Blunt E1表达载体、氨苄青霉素、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)购自北京全式金生物公司；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒和SanPrep柱式DNA小量抽提试剂盒，生工(上海)公司；引物由生工(上海)公司合成。

1.2 仪器与设备

Nano- 100型分光光度计，杭州奥盛仪器公司；TC- 96型PCR仪，杭州博日公司；Universal Hood Ⅱ型全自动凝胶成像仪和蛋白电泳仪，美国Bio- Rad公司；EPS300 DNA型电泳仪和电泳槽，上海天能公司；E2695型高效液相色谱系统，美国Waters公司。

1.3 实验方法

1.3.1 重组大肠杆菌的构建

根据NCBI数据库中公开的根癌农杆菌编码的DPEase基因 (KX098480.1)，设计引物，上游引物：5′- CAGAAAAGCGAAAGAGACACC -3′；下游引物：5′- TGAGGATATTATCGCAAATC -3′；以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增DPEase基因，回收目的片段，将目的片段与pEASY-Blunt E1载体连接，转化E.coli DH5α 感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒，测序，重组质粒转化E.coli BL21，通过抗性培养基筛选转化子，PCR鉴定拟转化子。

1.3.2 生物信息学分析

采用NCBIBLAST比对核苷酸及氨基酸序列，通过NCBI在线ORF finder寻找基因编码框，利用Prot-Param在线软件分析蛋白质的理化性质，采用Signal P 4.1 Server预测蛋白信号肽，利用TMHMM 2.0 Server分析蛋白质的跨膜区，采用Predict Protein在线工具预测蛋白质二级结构，利用 Swiss-Model在线工具预测蛋白质三级结构。

1.3.3 重组DPEase的诱导表达和分离纯化

重组E.coli BL21接种于200 mL含100 μg/mL氨苄的LB培养基中，37 ℃ 200 r/min振荡培养，过夜，然后加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，在温度16 ℃和摇床转速150 r/min的条件下培养32 h，诱导重组菌表达外源蛋白。在4 ℃下，8 000 r/min离心10 min，收集菌体，生理盐水洗涤3次，缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH=8)重悬；在冰浴条件下，超声(功率300 W，工作3 s，间歇5 s，90次)破碎细胞，12 000 r/min离心15 min收集上清液，获得粗酶液；用0.22 μm微孔滤膜过滤粗酶液，将粗酶液加到层析柱上，低浓度咪唑洗脱液洗脱杂蛋白质，高浓度咪唑洗脱液洗脱目的蛋白质，目的蛋白质放入10 kDa的超滤管中浓缩除杂，SDS-PAGE检测重组DPEase。

层析柱预处理是在4 ℃条件下，采用上样缓冲液(50 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，pH=7.4)平衡Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow亲和层析柱。低浓度咪唑洗脱液为50 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑，pH=7.4。高浓度咪唑洗脱液为50 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH=7.4。

1.3.4 D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活力测定

设置的5 mL催化反应体系中含有1 mL酶液、500 g/L D-果糖和50 mmol/L Tris-HCl(pH=8)，在55 ℃和150 r/min条件下保温10 min，采用高效液相色谱法测定D-阿洛酮糖的含量[19]，液相色谱柱为RezexTM RCM-monosaccharide Ca2+ (Phenomenex IncTorrance, USA)，检测器为2410型示差检测器，流动相为超纯水。设置参数：柱温80 ℃，流速0.4 mL/min，进样量10 μL。单位酶活力定义为1 min生成1 μmol D-阿洛酮糖为一个酶活力单位，以U/mL表示。

2 结果与分析

2.1 重组大肠杆菌的构建结果

以提取的根癌农杆菌基因组DNA为模板，根据DPEase序列设计的引物进行扩增，电泳结果见图1。

泳道M 为marker，1为阴性对照，2～4为扩增产物。
图1 根癌农杆菌DPEase基因的PCR扩增结果
Fig.1 PCR amplification of A. tumefaciens DPEase gene

由图1可知，电泳检测出一条约900 bp的目的片段，与预期大小一致。

目的片段与表达载体pEASY-Blunt E1连接，转化E. coli DH5α，通过抗性筛选，提取转化子质粒，测序验证正确，转化导入宿主菌E.coli BL21中，通过抗性固体培养基筛选转化子，采用DPEase引物PCR扩增转化子基因组，鉴定工程菌，见图2。

泳道M为marker，1～4为拟转化子扩增产物，5为阴性对照，6为阳性对照。
图2 PCR鉴定DPEase E. coli BL21转化子
Fig.2 PCR identification of DPEase transformants of
E. coli BL21

由图2可知，被检测的转化子都能扩增出与目的基因预期一致的DNA条带，初步说明构建的表达质粒已转化入E.coli BL21细胞内。

2.2 生物信息学分析结果

2.2.1 序列分析

对测定的DPEase序列进行开放阅读框分析，结果表明，该序列包含1个完整的开放阅读框，由870 bp核苷酸组成，编码289个氨基酸。通过在线同源性分析，该基因与NCBI的Genbank数据库中根癌农杆菌编码D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因 NCIM：2942(KX098480.1)的核苷酸序列相似性为99.43%。

2.2.2 DPEase蛋白的理化性质分析

采用软件Prot Param预测DPEase的理化性质，结果显示，DPEase蛋白由289个氨基酸组成，其中含量最高是甘氨酸G，占11.07%，其次是丙氨酸A，占10.73%，最低的是谷氨酰胺Q和半胱氨酸C；带负电的残基(Asp+Glu)37个，带正电的残基(Arg+Lys)31个；其理论分子质量31 493.62，共由4 406个原子组成，分子式为C1 410H2 182N390O417S7，等电点PI为6；根据蛋白质的平均疏水性值判断蛋白质的疏水性，该蛋白为亲水性蛋白。

2.2.3 信号肽和跨膜区的预测结果

通过Signal P 4.1 Server的人工神经网络算法对DPEase蛋白进行信号肽预测，结果如图3。

图3 Signal P- 4.1预测DPEase蛋白信号肽得分
Fig.3 Prediction scores of DPEase signal
peptide by Signal P- 4.1

由图3可知，Y得分最高分值(0.143)为第12位的组氨酸残基，S得分为0.107，DPEase基因所编码的蛋白无信号肽，为非分泌蛋白。

利用TMHMM 2.0 Server进行DPEase蛋白的跨膜区分析，结果见图4。

图4 基于TMHMM的后验概率跨膜区分析结果
Fig.4 Analysis of transmembrane region based on
TMHMM posterior probability

由图4可见，该蛋白质在膜内的概率仅为0.063 42，所编码的289个氨基酸从1到289全部在膜外；跨膜螺旋数为0，图中未出现矩形跨膜区。因此，该蛋白质位于细胞膜外，无跨膜区。

2.2.4 DPEase蛋白的二级结构

Predict protein预测结果表明，DPEase蛋白含有13个α-螺旋和8个β-折叠，α-螺旋占38.41%，β-折叠47.06%，另外，14.53%的氨基酸处于无规则卷曲状态；非跨膜蛋白、α-螺旋跨膜蛋白和β-桶状跨膜蛋白的可能性依次为0.997 2、0.002 6和0.000 2，因此，DPEase属于非跨膜蛋白，预测结果与TMHMM 2.0 Server软件分析结果一致。

2.2.5 DPEase蛋白的三级结构

根据Swiss-Model在线软件进行建模预测，采用D-阿洛酮糖-3-差向异构酶2hk1.1.A为模型建立DPEase蛋白的三级结构，结果见图5。

图5 DPEase蛋白的四聚体和单体结构
Fig.5 Tetramer and monomer structure of DPEase

由图5可知，DPEase的氨基酸序列与2hk1.1.A模板的序列一致性为99.65%，建模的可信度较高。该DPEase的氨基酸序列在191位与模型有差异，此位点不属于活性结合位点；另外，I66、G67、G106、A107、W112、E150、L152、E156、D183、H186、H209、R215、E244和I257为D-果糖催化活性位点；E150、D183、H209和E244为Mn2+离子结合位点。

2.3 重组大肠杆菌的诱导表达结果

在16 ℃下，1 mmol /L IPTG 诱导重组菌E.coli BL21表达DPEase，结果见图6。

图6 IPTG 诱导E.coli BL21工程菌表达DPEase酶活力
Fig.6 DPEase activities of E.coli BL21 engineered
strain induced by IPTG

由图6可知，随着诱导时间增长，目的蛋白表达量增大，而当诱导24 h后，酶活增加缓慢，目的蛋白表达量在28 h时达到最大值0.32 g/L，酶活性最高为3.8 U/mL。

2.4 重组DPEase的分离纯化结果

通过Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow亲和层析柱，利用重组pEASY-Blunt E1-DPEase质粒带有的组氨酸标签和不同浓度的咪唑洗脱液，分离出目的蛋白，SDS-PAGE结果见图7。

图7 SDS-PAGE分析纯化的DPEase
Fig.7 SDS-PAGE analysis of purified DPEase

由图7可知，纯化后的蛋白质为单一条带，分子质量约为33 kDa，根癌农杆菌DPEase基因能够在E.coli BL21宿主中表达。

3 结 论

本文通过生物信息学分析根癌农杆菌DPEase蛋白结构，实验结果与已报道的结论接近。在分子质量预测上，本研究和Park等[20]研究表明，根癌农杆菌DPEase分子质量为33 kDa，与软件Prot Param预测的理论分子质量31 493.62相近；在DPEase晶体结构上，已有研究表明，DPEase蛋白为四聚体结构，每个单体呈典型TIM桶状，由(β/α)8结构组成，每个单体含有13个α-螺旋和8个β-折叠[14]，与本研究通过生物信息学预测获得的结果相一致；在三级结构的活性位点分析方面，Kim等[14]通过定点突变研究表明，位点I66、A107、W112、E156和R215影响根癌农杆菌DPEase结合D-果糖的效率，H209影响Mn2+与底物结合[21]，本研究通过预测，获得相似的结论。本研究通过分子克隆和原核表达检测根癌农杆菌DPEase的性质，与已知报道接近[14，21]，研究表明，通过构建原核表达载体能够实现DPEase的高效表达，但其酶学性质以及在催化产D-阿洛酮糖等方面的应用还需进一步研究。

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Gene Cloning, Structural Prediction, and Prokaryotic Expression of Agrobacterium tumefaciens D-Psicose-3-Epimerase

ZHU Xingxing, YANG Peizhou*, DU Mingrui, WU Yun, JIANG Shaotong

(School of Food and Biological Engineering/Anhui Key Laboratory of Intensive Processing of Agricultural Products, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Abstract： D-Psicose can be converted from D-fructose catalyzed by D-psicose-3-epimerase. To realize the heterologous expression of D-psicose-3-epimerase (DPEase), the primers were designed to clone and isolate the gene. The DNA sequences and structural characteristics of DPEase were analyzed by bioinformatics. The results showed the gene possessed 870bp open reading frame and encoded 289 amino acids. Alpha helix, beta folding, and random coil respectively accounted for 38.41%, 47.06%,and 14.53% in the secondary structure of the protein. The protein located at the cell membrane belonged to a hydrophilic protein without the signal peptide and transmembrane region. The prokaryotic expression vector was constructed and transferred into the E. coli BL21. The molecular weight of DPEase was appropriately 33 kDa. After an induction of 1 mmol/L IPTG for 28 h, the protein amount and enzymatic activity of the recombinant E. coli BL21 were 0.32 g/L and 3.8 U/mL. The DPEase gene of A. tumefaciens could be expressed in the engineered E. coli.

Keywords： D-psicose-3-epimerase; D-psicose; Agrobacterium tumefaciens; gene cloning; prokaryotic expression

中图分类号： TS201.3

文献标志码：A

收稿日期： 2018-01-26

基金项目： 安徽省科技攻关项目(1604a0702001)；安徽省自然科学基金资助项目(1908085MC80)。

第一作者： 朱星星，女，硕士研究生，研究方向为食品安全与检测。

*通信作者： 杨培周，男，副教授，博士，主要从事农产品加工方面的研究。

doi:10.3969/j.issn.2095-6002.2019.03.008

文章编号：2095-6002(2019)03-0061-06

引用格式：朱星星，杨培周，杜明睿，等. 根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因克隆、结构预测及原核表达[J]. 食品科学技术学报，2019,37(3):61-66.

ZHU Xingxing, YANG Peizhou, DU Mingrui, et al. Gene cloning, structural prediction, and prokaryotic expression of Agrobacterium Tumefaciens D-psicose-3-epimerase[J]. Journal of Food Science and Technology, 2019,37(3):61-66.

(责任编辑：李 宁)