DOI:10.12301/spxb202200971
中图分类号:R285.5
灵芝孢子油对四氯化碳联合高脂饮食诱导大鼠肝纤维化的作用研究
路子佳1， 范春雪2， 辛念2， 谢瑶1
| 【作者机构】 | 1北京东方红航天生物技术股份有限公司； 2北京理工亘舒科技有限公司 |
| 【分 类 号】 | R285.5 |
| 【基 金】 |
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灵芝孢子油对四氯化碳联合高脂饮食诱导大鼠肝纤维化的作用研究
肝纤维化是肝损伤、肝炎等问题导致的肝星形细胞被激活，肝内胶原纤维发生异常增生的病理过程[1-2]。研究表明，早期肝纤维化具有可逆转性，采用调整膳食结构及制剂干预等方式可以改善肝组织的病理情况，包括降低肝纤维化指标、减少炎症细胞的浸润等[3-4]。
灵芝是我国传统药食两用真菌，具有几千年的食用历史。现代研究发现，灵芝中多种活性成分具有良好的肝脏保护作用，其中含量最高的是灵芝多糖和三萜类化合物，以及多种微量成分，包括生物碱、核苷、甾醇、多肽、氨基酸等[5-6]。在灵芝成熟期，灵芝孢子从菌盖弹射出来，呈淡雾状，含有灵芝子实体几乎所有的活性物质，其中总三萜、总多糖含量明显高于灵芝子实体[7]。目前，关于灵芝在肝脏保护作用及机制方面的研究已有较多报道，但相关研究主要集中在灵芝子实体、灵芝孢子、灵芝提取物对肝损伤的保护作用，发挥作用的有效成分通常被认为是灵芝多糖、三萜类等。而对于灵芝孢子油(Ganoderma lucidum spore oil，GSO)的研究较少。
GSO是以破壁灵芝孢子粉经二氧化碳超临界萃取得到的脂溶性混合物，其主要成分为脂肪酸、灵芝三萜、甾醇等[8-10]。赵灏等[11]研究发现，GSO能显著降低四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化大鼠血浆谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)的水平，降低肝组织中丙二醛(MDA)的含量，减轻肝脏纤维化程度。三萜类物质作为灵芝的主要活性成分之一，能有效改善乙酰氨基酚诱导的肝损伤，降低血清中ALT、AST和乳酸脱氢酶水平以及肝组织中MDA含量，提高肝脏还原型谷胱甘肽(GSH)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性[12]。Li等[13]研究发现，灵芝三萜灌胃后，鸡肝脏中抗氧化酶的活性提高，镉累积、MDA含量以及炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6等的水平均出现显著下降。由此可见，GSO可以通过抗氧化和抗炎等途径对肝损伤起到改善作用，其保肝活性可能与含有三萜类化合物活性成分相关。
CCl4是一种较为常用的肝损伤诱导剂，所致的肝损伤可导致肝纤维化的发生，最终发展为肝硬化[14-15]。采用低浓度的CCl4配合高脂饲料造模还可以模拟日常生活中高热量等饮食因素对肝纤维化的影响，如脂肪在肝细胞内积累，细胞内脂肪空泡增多等，使研究更贴近于临床实际[16]。本研究旨在通过对不同浓度的GSO对CCl4联合高脂饲料喂养致肝纤维化大鼠的肝功能损伤、氧化损伤及肝纤维化的影响进行研究，探究其可能的机制，以期为GSO在保护肝部健康及肝纤维化的改善方面提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
雄性SPF级SD大鼠(体质量150～170 g)60只，中国食品药品检定研究院[许可证号：SCXK(京)2017-0005]。普通生长饲料(22023211)，北京科澳协力饲料有限公司。高脂饲料(20210463)，北京华阜康生物科技股份有限公司[许可证号：京饲证(2019)06076]。各组大鼠均饲养于北京理工大学SPF级实验动物中心(动物伦理号：SYXK-BIT-20211223025)，12 h昼夜循环、温度(22±2)℃、湿度50%±5%环境下，动物均自由进食饮水。
1.2 材料与试剂
复方鳖甲软肝片(国药准字：Z19991011)，内蒙古福瑞医疗科技股份有限公司；CCl4(CAS：56-23-5)，北京普诺欣生物科技有限公司；ALT测试盒(货号：C009-2-1)、总胆红素(TBIL)试剂盒(货号：C019-1-1)、AST测试盒(货号：C010-2-1)、碱性磷酸酶(AKP)测定试剂盒(货号：A059-2-2)、羟脯氨酸(Hyp)测定试剂盒(货号：A030-2-1)、MDA测试盒(货号：A003-1-2)、GSH测试盒(货号：A006-2-1)、SOD测试盒(货号：A001-3-2)，南京建成生物工程研究所；透明质酸(HA)测试盒、层黏蛋白(LN)测试盒、Ⅳ型胶原(Col Ⅳ)测试盒、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)测试盒、MMPs组织抑制物-1(TIMP-1)测试盒，上海酶联生物科技有限公司。
1.3 仪器与设备
C3M型酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；TU-1810型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；JY6001型电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司；HHS-4S型水浴锅，上海光地仪器设备有限公司；5 mL肝素钠抗凝采血管，石家庄康卫仕医疗器械有限公司。
1.4 实验方法
1.4.1 灵芝孢子油的制备
将破壁灵芝孢子粉过60目筛后置于萃取釜中，在压力30 MPa、温度45 ℃、二氧化碳流速2.0～2.5 m3/h的条件下萃取4 h，减压蒸馏后得淡黄色透明的GSO。经测定，GSO过氧化值为1.1 mg/g，含有总三萜(以齐墩果酸计，310 mg/g)、麦角甾醇(1.12 mg/g)[17]。GSO中剩余成分以脂肪酸为主[8,18]。
1.4.2 动物分组及处理
SD大鼠适应性饲养1周，按照体质量随机分为空白对照组(BC)、模型对照组(MC)、阳性药物组(PC)、灵芝孢子油低(GSOL)、中(GSOM)、高(GSOH)剂量组，每组10只大鼠。BC大鼠不造模，使用普通生长饲料进行饲养。其余各组大鼠连续灌胃含有体积分数为0.40的CCl4的玉米油6周，每周2次，按照大鼠体质量首次灌胃5 mL/kg，其余每次灌胃3 mL/kg，同时使用高脂饲料进行饲养，建立大鼠肝纤维化模型[19]。造模的同时开始灌胃GSO和阳性对照药物。按照大鼠体质量进行灌胃处理，MC大鼠灌胃玉米油，PC大鼠灌胃复方鳖甲软肝片540 mg/kg，GSOL、GSOM、GSOH大鼠分别灌胃900、2 700、5 400 mg/kg的GSO。所有大鼠每日灌胃1次，连续8周。
阳性药物复方鳖甲软肝片适应用慢性肝炎，脂肪肝等多种原因所引起的肝纤维化[20]。灵芝孢子油人体推荐量为2 g/d，按成人体质量70 kg计算，人体推荐剂量为28.6 mg/kg，按人体推荐量的5、15、30倍剂量给大鼠灌胃[21]。实验期间，密切观察大鼠的精神状态。每周测定各组大鼠体质量、饮水量、进食量。
1.4.3 指标测定
GSO干预8周后，采用质量分数为10%的水合氯醛溶液，按照大鼠体质量(350 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。负压采血管(肝素抗凝管)腹主动脉取血，室温静置2 h，2 500 r/min、4 ℃离心15 min，分离血浆。解剖取肝脏，按质量(g)与体积(mL)比1∶9，加入生理盐水，冰水浴条件下，制备肝脏组织匀浆液，2 500 r/min离心10 min，取上清液待测。微板法及ELSA法检测血浆中ALT、AST、TBIL、Hyp、AKP、HA、LN、Col Ⅳ的水平，及肝组织中SOD活性和MDA、GSH、MMP-9、TIMP-1的含量。
1.4.4 肝组织病理检测
取大鼠左叶肝脏，制作石蜡切片后，进行苏木精- 伊红(HE)染色、显微镜观察；石蜡切片脱蜡水化后进行Masson染色、显微镜观察，具体操作步骤参照文献[22]。使用Eclipse Ci-L拍照显微镜选取组织的目标区域进行200倍成像。Masson染色结果使用Image-Pro Plus 6.0软件分析，测定胶原纤维累积光密度值(integral optimistically，IOD)、组织像素的面积(Area)，计算胶原面积占比及面密度(IOD/Area)。
1.5 数据处理
应用SPSS 19.0将数据结果进行统计学分析，实验数据以平均值±标准偏差
表示，各组间采用One-way ANOVA分析，组间两两比较采用LSD检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果与讨论
2.1 GSO对大鼠存活率和体质量的影响
肝纤维化大鼠生存情况见表1。由表1可知，BC大鼠在8周的实验期间无死亡，而MC大鼠及GSOL、GSOM大鼠出现死亡情况。在前6周的CCl4联合高脂饮食诱导期间，MC和GSOM大鼠死亡1只，2组大鼠存活率降低至90%。在CCl4联合高脂饮食诱导后2周期间，MC、GSOL、GSOM大鼠继续出现死亡数量增加的趋势，其中MC和GSOL大鼠死亡数量最高，存活率降低至70%。对照药物和高剂量GSO干预能够有效降低肝纤维化大鼠的死亡率，GSOM大鼠的存活率上升至80%。高剂量GSO保护效果最优，大鼠存活率达到100%。由表1可知，实验开始前后各组大鼠体质量差异不显著(P>0.05)。实验结果表明，GSO可以改善实验大鼠的生存状态，对CCl4联合高脂饲料造大鼠肝纤维化模型具有明显的提升大鼠存活率作用。
表1 大鼠存活率及体质量
Tab.1 Survival rate and body weight of rats
组别存活率/%体质量/gt/周t/周1234567808BC100100100100100100100100188.5±9.5427.8±47.3MC100100100100100907070188.4±11.5395.0±42.6PC100100100100100100100100189.7±8.7421.0±30.4GSOL1001001001001001007070187.2±9.1387.9±44.4GSOM10010010010090908080187.5±8.9397.5±39.8GSOH100100100100100100100100189.8±5.8427.0±64.6
2.2 GSO对大鼠肝组织病理变化的影响
大鼠肝脏切片HE染色结果见图1。由图1可知，BC大鼠肝小叶结构、肝细胞大小正常，汇管区未见纤维组织增生及炎细胞浸润，无脂肪变性等异常。采用CCl4配合高脂饲料造模后，MC、GSOL、GSOM大鼠的肝组织出现不同程度的肝损伤病变。MC大鼠的肝脏组织出现明显的肝索和肝血窦紊乱，汇管区及中央静脉周围可见明显的胶原纤维增生、炎性细胞浸润、静脉间互相连接，形成纤维桥接(黑色箭头)。同时MC大鼠肝脏组织还伴随汇管区周围胆管增生、胆管轻度扩张(绿色箭头)，出现明显的肝细胞脂肪变性、肝细胞体积增大。MC大鼠肝脏胞质内可见大量甘油三酯蓄积导致的圆形空泡(黄色箭头)，出现较多的肝细胞水肿、胞质疏松淡染(红色箭头)。肝脏组织切片形态观察结果显示，与MC大鼠相比，阳性药物和GSO干预能够显著缓解肝纤维化大鼠相应症状。PC大鼠肝脏出现脂质沉积、纤维桥接、胆管增生和扩张等症状减轻。GSO干预也显著抑制了大鼠肝纤维化的进展，GSOM大鼠肝脏仅出现少量的脂质沉积。而高剂量GSO干预的保护效果最优，大鼠肝脏组织形态基本恢复至正常状态。研究结果证实，GSO能够显著改善肝纤维化病变，并与PC大鼠相比，GSO还显著抑制了高脂饮食导致的肝脂肪变性。
黑色箭头标识纤维形成，绿色箭头标识胆管病变，黄色箭头标识脂质积累，红色箭头标识细胞病变。
图1 大鼠肝脏HE染色
Fig.1 HE staining of rat liver
大鼠肝脏切片Masson染色结果如图2。由图2可知，MC大鼠肝脏组织出现不同静脉间增生的胶原纤维(蓝色)互相连接形成假小叶(橙色箭头)。GSO干预组大鼠肝组织病理变化较MC组均有改善，其中高剂量GSO改善效果最优，GSOH大鼠的肝组织大部分肝细胞结构完整、排列整齐，炎性细胞浸润、胆管扩张、脂肪变性、细胞水肿等异常改变明显减轻。胶原面积占比及面密度结果显示，MC大鼠肝脏组织胶原面积占比及面密度均极显著高于BC大鼠(P<0.01)。而与MC相比，GSOM、GSOH胶原面积占比值及面密度显著降低。实验结果表明，GSO可显著改善CCl4联合高脂饮食诱导的大鼠肝脏病变。
橙色箭头标识假小叶。与BC比较，*表示差异具有显著性(P<0.05)，** 表示差异具有极显著性(P<0.01)；与MC组比较，#表示差异具有显著性(P<0.05)，## 表示差异具有极显著性(P<0.01)。
图2 大鼠肝脏纤维化分析
Fig.2 Analysis of liver fibrosis in rats
2.3 GSO对大鼠肝功能的影响
各组大鼠肝功能相关指标检测结果见图3。如图3所示，与BC大鼠比较，MC大鼠血浆中ALT、AST、TBIL、AKP水平极显著升高(P<0.01)。而与MC大鼠比较，阳性药物、中、高剂量GSO可以显著降低肝纤维化引起的血浆ALT、AST、AKP的升高，PC、GSOM、GSOH大鼠血浆中ALT水平分别降低36.1%、55.2%、44.6%，AST水平分别降低30.2%、36.3%、35.0%，AKP水平分别降低23.5%、33.6%、33.8%。与MC组比较，PC和GSO干预组均可以极显著改善由于CCl4联合高脂饮食诱导引起的大鼠血浆TBIL水平的升高(P<0.01)。相较于MC，PC、GSOL、GSOM、GSOH大鼠血浆TBIL水平分别降低了54.7%、35.6%、64.0%、55.9%。且与BC大鼠相比，PC和GSO干预组大鼠血浆TBIL水平差异不显著(P>0.05)。在4项肝功能指标中，GSOM和GSOH大鼠的肝功能指标水平与PC大鼠不具有显著性差异(P>0.05)。实验结果表明，GSO能够显著改善CCl4联合高脂饮食诱导的大鼠肝损伤，并且中、高剂量GSO对于肝损伤的保护效果与阳性药物一致。
各组大鼠肝脏氧化应激指标检测结果见图4。由图4可知，与BC大鼠比较，MC大鼠肝组织中MDA含量显著升高(P<0.01)，GSH含量与SOD活性显著降低(P<0.01)。而与MC组比较，阳性药物和高剂量GSO可以显著降低大鼠肝损伤引起的肝脏MDA含量的升高(P<0.01)，显著升高GSH含量(P<0.05)，其中MDA含量分别降低了11%、19%，GSH含量分别升高9%、12%。阳性药物和中、高剂量GSO则可显著提高肝纤维化大鼠肝组织中SOD活性，分别提高13%、12%、19%。同时，高剂量GSO对于肝脏氧化应激指标的改善，与PC大鼠相比不具有显著性差异(P>0.05)。实验结果表明，高剂量GSO能够显著改善CCl4联合高脂饮食诱导的大鼠肝脏氧化应激，并且其保护作用与阳性药物的保护效果一致。
2.4 GSO对大鼠肝纤维化的影响
大鼠血浆肝纤维化相关指标检测结果见图5。由图5可知，与BC大鼠比较，MC大鼠血浆中HA、LN、Col Ⅳ、Hyp的含量均出现极显著升高(P<0.01)。而与MC比较，GSOH大鼠血浆中HA的含量降低15.9%，LN的含量降低6.8%，且差异均具有显著性(P<0.05)。同时，GSOM、GSOH大鼠血浆中Col Ⅳ的含量分别降低9.0%、9.7%，Hyp的含量分别降低14.6%、26.5%，且差异均具有显著性。高剂量GSO对于肝纤维化指标的改善效果与阳性药物之间的差异不具有显著性(P>0.05)。实验结果表明，高剂量GSO能够显著改善CCl4联合高脂饮食诱导的大鼠肝脏纤维化，并且其保护作用与阳性药物的保护效果一致。
2.5 GSO对大鼠肝脏MMP-9和TIMP-1蛋白水平的影响
大鼠肝纤维化相关蛋白表达水平如图6。由图6可知，与BC大鼠比较，MC大鼠肝组织中MMP-9水平明显降低(P<0.05)。而阳性药物与GSO干预均不同程度升高肝组织中MMP-9水平，其中GSOH大鼠肝组织中MMP-9水平升高最为显著(P<0.05)，其MMP-9水平提高7.16%。与BC组比较，MC大鼠肝脏的TIMP-1水平明显升高(P<0.05)；阳性药物与GSO干预均不同程度的降低，其中PC大鼠肝脏TIMP-1水平降低最为显著(P<0.05)，其水平降低11.9%。实验结果表明，高剂量GSO能够显著改善CCl4联合高脂饮食诱导的大鼠肝纤维化相关蛋白表达改变，并且其保护效果可能依赖MMP-9的表达。
与BC比较，*表示差异具有显著性(P<0.05)，**表示差异具有极显著性(P<0.01)；与MC组比较，#表示差异具有显著性(P<0.05)，##表示差异具有极显著性(P<0.01)。
图3 大鼠血浆肝功能相关指标
Fig.3 Liver function related-indexs of rat plasma
与BC比较，*表示差异具有显著性(P<0.05)，**表示差异具有极显著性(P<0.01)；与MC组比较，#表示差异具有显著性(P<0.05)，##表示差异具有极显著性(P<0.01)。
图4 大鼠肝组织氧化应激水平
Fig.4 Level of oxidative stress in rat liver tissues
与BC比较，*表示差异具有显著性(P<0.05)，**表示差异具有极显著性(P<0.01)；与MC组比较，#表示差异具有显著性(P<0.05)，##表示差异具有极显著性(P<0.01)。
图5 大鼠血浆肝纤维化相关指标
Fig.5 Liver fibrosis indexs of rat plasma
与BC比较，*表示差异具有显著性(P<0.05)；与MC组比较，#表示差异具有显著性(P<0.05)。
图6 大鼠肝脏MMP-9与TIMP-1水平
Fig.6 Level of MMP-9 and TIMP-1 in rat liver
3 讨 论
CCl4致肝损伤时，会使血浆中ALT、AST、TBIL水平升高，同时还可降低肝组织中GSH水平及SOD活性，引起脂质过氧化，从而使得MDA含量激增，这些指标的变化程度与肝细胞或组织的受损程度密切相关。采用GSO进行干预后，肝纤维化大鼠肝组织结构得到不同程度的改善，其中GSOH大鼠的肝组织与MC比较，大部分肝细胞结构完整且排列整齐，炎性细胞浸润、胆管扩张、脂肪变性、细胞水肿等异常改变明显减轻，同时可显著降低大鼠血浆中ALT、AST、TBIL、AKP水平及大鼠肝脏组织中MDA的水平，提高GSH含量与SOD活性，证明GSO具有提高肝脏抗氧化能力的作用，可改善肝功能、减轻肝损伤。
当肝细胞损伤使周围非实质细胞受到不断刺激，导致HA、LN、Col Ⅳ、Hyp等肝脏细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)大量形成并沉淀，进而导致肝组织结构破坏，肝纤维化的形成[23-24]。其中HA 由肝间质细胞合成，其水平与肝内纤维量及肝细胞受损程度呈正相关[25-26]。LN为基底膜中特有，是慢性肝炎、肝硬化及肝癌指标[26]。Col Ⅳ在肝纤维化时最早出现，纤维组织生成过程中大量沉积，是肝纤维化早期与肝硬化的重要指标之一[27]。Hyp是胶原代谢的重要产物，是组织纤维化检测的基本指标[28]。MMP-9具有降解ECM中的各种蛋白成分等作用[29]；而蛋白酶抑制剂TIMP-1则具有抑制MMP-9的表达的作用，因此MMP-9/TIMP-1信号转导失调是促进肝纤维化及肝癌发展的重要原因[29-30]。采用GSO进行干预后，各给药组大鼠肝脏不同静脉间胶原纤维增生的情况明显改善。其中GSOH大鼠的肝脏胶原面积占比值及面密度、血浆中肝纤维化指标(HA、LN、Col Ⅳ、Hyp)水平显著降低。同时，GSOH大鼠的肝脏MMP-9表达水平显著上调(P<0.05)，而TIMP-1表达下调未出现显著差异。研究结果证明，GSO具有抗肝纤维化的作用，包括降低ECM含量、抑制ECM的形成。因此，本研究推测GSO发挥保肝作用机理与其调控MMP-9的表达有关。
本研究结果与赵灏等[11]、胡宗苗等[31] 采用注射 CCl4 构建肝纤维化模型，并以GSO、破壁灵芝孢子粉进行干预的研究结果一致。同时，结合陈洁等[32]、敖艳霞等[12]对灵芝三萜在肝保护方面的研究结果，即灵芝三萜可降低肝脏中MDA水平，提高肝脏GSH水平和SOD活性，能通过下调TGF-β1 mRNA、MMP-2蛋白的表达抑制肝组织的纤维化。推测GSO中起到减轻肝损伤、抑制肝脏纤维化的作用与其含有的生物活性成分三萜类化合物有关。
4 结 论
本研究结果表明，灵芝孢子油可以改善CCl4联合高脂饮食诱导的肝纤维化大鼠生存状态和肝损伤。高剂量GSO干预可显著改善肝组织病理情况，降低血浆肝功能相关指标(ALT、AST、TBIL)水平及肝组织中MDA含量，提高GSH含量与SOD活性。本研究结果表明，中、高剂量GSO(人体推荐量的15、30倍剂量)能够提高肝抗氧化能力，减轻肝损伤。同时，GSO干预可降低大鼠血浆HA、LN、Col Ⅳ、Hyp的含量，显著升高肝脏MMP-9蛋白的表达，具有抑制肝脏纤维化的作用，其作用机理可能与调控MMP-9/TIMP-1信号通路有关。本研究旨在探究GSO改善肝纤维化的规律及作用机制，以期为GSO在保护肝脏健康及肝纤维化的改善方面提供科学依据。
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