功能性低聚糖是由2～10个单糖通过糖苷键连接成的碳水化合物聚合物[1]。其中,低聚半乳糖(galacto-oligosaccharide, GOS)是由1～4个半乳糖分子以β(1→6)、β(1→3)、β(1→4)糖苷键形式连接在乳糖分子的半乳糖基形成[2]。GOS可以促进肠道双歧杆菌增殖[3]、修复肠道炎症[4],且GOS与菊粉复合物被证明具有潜在的抗过敏作用[5]。低聚果糖(fructo-oligosaccharides, FOS)是在蔗糖分子上以β-1,2-糖苷键结合数个D-果糖所形成的一组低聚糖的总称,包括蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)、蔗果五糖(GF4)等[6]。FOS具有调节肠道菌群[7]、抑制炎症[8]、调节肠道屏障[9]等多种活性[10],且因其甜度适中、热量低、升糖指数低被应用于功能食品[11]。另外,FOS和GOS的组合物也被证明有功能活性,目前已应用于模拟母乳低聚糖[12],其中FOS和(或)GOS在婴幼儿配方乳粉中的添加量为1%～3%[13]。在婴儿配方乳粉中添加FOS和GOS的组合物可促进婴儿肠道双歧杆菌的生长,软化粪便,使其粪便特征与母乳喂养的婴儿相似[14-17]。另外,Overbeek等[18]采用人结肠腺癌细胞系HT-29细胞和人外周血细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)联合培养模型,发现FOS与GOS的组合物可以调节T细胞分化。

目前普遍认为,低聚糖通过两种途径发挥免疫调节作用,一是借助其益生元作用,促进肠道益生菌的生长和代谢,通过维护胃肠道的第一道防线,间接改善免疫代谢[19]。例如通过促进双歧杆菌的增殖来极化新生儿树突状细胞(dendriticcell,DC),驱动T细胞分化[20],且益生菌的代谢物如短链脂肪酸(SFCA)会抑制有害菌及病原体生长。二是通过与特定糖受体相互作用或其他途径直接影响免疫细胞,如GOS有助于Caco-2肠上皮细胞分化和屏障修复[21]。目前有关低聚糖免疫调节活性的研究多以对动物模型灌胃为主,但有关低聚糖对免疫系统的直接作用还需采用细胞模型进一步探究。

脾脏是免疫应答的重要场所[22],富含B淋巴细胞和T淋巴细胞,二者分别介导体液免疫和细胞免疫,其中辅助型T细胞(Th细胞)可以产生和释放细胞因子,对建立适应性免疫反应至关重要[23]。Th细胞可分化成Th1和Th2亚型,Th1细胞分泌干扰素-γ(interfereron gamma, INF-γ)、白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)等细胞因子,Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子[24]。正常情况下,体内Th1与Th2细胞的增殖分化处于平衡,在受过敏原二次刺激时,脾脏内的DC细胞调节失控,导致Th细胞向Th2亚型极化,引起Th1/Th2失衡,进而产生Th2细胞免疫紊乱相关过敏性疾病,如食物过敏,变应性鼻炎、变应性哮喘、结膜炎等[25]。

本研究旨在基于小鼠脾淋巴细胞模型,探究FOS、GOS及FOS-GOS组合物(FOS+GOS)对小鼠脾淋巴细胞增殖及分化的影响,为二者的免疫调节及潜在抗过敏应用提供科学依据与理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

雌性BALB/c小鼠,北京维通利华实验动物技术有限公司;低聚果糖、低聚半乳糖,量子高科(广东)生物有限公司;RPMI-1640培养基,赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司;胎牛血清、青霉素/链霉素,美国Invitrogen公司;刀豆蛋白(concanavalin A, ConA)(纯度为90%)、焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)、红细胞裂解液,上海碧云天生物技术有限公司;噻唑蓝(MTT)(纯度为98%),美国Amresco公司;二甲基亚砜(DMSO)(纯度为99%),天津市永大化学试剂有限公司;PBS缓冲液,北京索莱宝科技有限公司;RT-qPCR实验引物,英潍捷基(上海)贸易有限公司;cDNA合成试剂盒,加拿大ABM公司;小鼠γ干扰素酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorben assay,ELISA)试剂盒、小鼠白细胞介素4 ELISA试剂盒,北京冬歌博业生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

LS-35HD型立式压力蒸汽灭菌器,江阴滨江医疗设备有限公司;DK-98-II2KW型超净工作台,天津泰斯特仪器有限公司;TDZ5-WS型医用离心机,长沙平凡仪器仪表有限公司;MCO-17AC型CO2培养箱,日本Sanyo公司;iMARK型酶标仪,美国Bio-Rad公司;FQD-96A型荧光定量PCR仪,杭州博日科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠脾淋巴细胞制备

将小鼠取血后处死,用体积分数为75%的酒精浸泡3 min,解剖并分离脾。将脾磨碎后过2次筛。收集细胞悬液,离心后用红细胞裂解液除去红细胞。用RPMI-1640培养液重悬一次细胞沉淀,洗涤红细胞裂解液。用1 mL含质量分数为10%的胎牛血清的RPMI-1640培养液悬起细胞沉淀,并配制成密度为2×106个/mL的脾细胞悬液。

1.3.2 小鼠脾淋巴细胞增殖活性测定

分设FOS组、GOS组、FOS+GOS组3个实验组,另设阴性对照组(NC组)和阳性对照组(PC组)。各组均取100 μL小鼠脾淋巴细胞悬液进行培养,阴性对照组另加20 μL PBS缓冲液,阳性对照组将阴性对照组的10 μL缓冲液替换成ConA溶液(5 μg/mL),实验组将阳性对照组的10 μL缓冲液替换成不同浓度的低聚糖溶液。将各组细胞在37 ℃条件下,于体积分数为5%的CO2培养箱中培养72 h。培养结束后每孔加入20 μL MTT,继续培养4 h。将各组细胞以8 460 r/min离心5 min,吸去上清液,收集细胞沉淀,加入150 μL DMSO,振荡10 min后于570 nm处测OD值。

免疫调节活性用刺激指数(stimulate index, SI)表示,该值越大代表被试物的免疫调节活性越强。SI的计算方法见式(1)。

(1)

1.3.3 不同低聚糖作用下小鼠脾淋巴细胞增殖活性测定

实验分设阴性对照组、阳性对照组、低聚糖与ConA共同添加组、低聚糖单独添加组,加样及培养条件同1.3.2,其中被试物质量浓度为125 μg/mL。

1.3.4 小鼠脾细胞分泌细胞因子IFN-γ及IL-4的测定

将小鼠脾细胞分别与FOS、GOS、FOS+GOS共同孵育48 h,以3 000 r/min离心20 min,吸取上清液,于-80 ℃保存。严格按照ELISA试剂盒说明,测定IFN-γ及IL-4含量。

1.3.5 小鼠脾淋巴细胞因子mRNA表达量测定

将小鼠脾淋巴细胞与被试物共同孵育24 h,并将培养液离心,弃上清液,采用TRNzol试剂法[26]提取RNA。取10 μL RNA,加入4 μL的Mix溶液和6 μL的DEPC。短暂离心后进行反转录,程序设置为,按25 ℃ 10 min、42 ℃ 50 min、85 ℃ 5 min反应。反应体系体积为20 μL,包括1 μL cDNA、0.2 μL上游引物、 0.2 μL下游引物、10 μL SYBR Green和8.6 μL灭菌水。反应条件为预变性95 ℃ 180 s,扩增95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,循环数为40个。

1.4 数据分析

实验数据均采用平均值±标准差表示,采用IBM SPSS Statistics 26软件进行显著性分析,多组样本间差异的比较采用单因素方差分析(one way ANOVA)伴随Tukey多重比较,P<0.05时表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度低聚糖对小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响

不同质量浓度低聚糖对小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响,实验结果如图1。由图1可知,FOS、GOS、FOS+GOS对脾淋巴细胞增殖活性的影响均呈现一定的浓度依赖性。在FOS质量浓度为31.25～1 500.00 μg/mL时,FOS处理脾淋巴细胞增殖活性呈现先升高后降低的趋势,在FOS质量浓度为1 000.00 μg/mL时,SI值达到最高;在GOS与FOS+GOS质量浓度为31.25～1 000.00 μg/mL时,GOS与FOS+GOS处理组脾淋巴细胞增殖活性均呈现先升高后降低的趋势,并分别在质量浓度为250.00、125.00 μg/mL时,SI值达到最高。考虑到免疫调节的双向作用,综合几种低聚糖在质量浓度为125.00 μg/mL时免疫调节作用均呈上升趋势,后续实验选用低聚糖的质量浓度为125.00 μg/mL进行进一步研究。

2.2 不同低聚糖对小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响

在125 μg/mL质量浓度下,FOS、GOS,FOS+GOS对小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响,实验结果如图2。由图2可见,在没有ConA刺激时,FOS+GOS处理的脾淋巴细胞增殖活性最强,SI值为2.31±0.02,且与FOS、GOS处理组差异显著(P<0.05),说明FOS和GOS处理具有一定的协同作用。在有ConA刺激时,FOS、GOS及FOS+GOS处理的脾淋巴细胞活性的增殖效果无显著差异(P>0.05)。

2.3 不同低聚糖对小鼠脾淋巴细胞Th1、Th2型细胞因子分泌的影响

FOS、GOS及FOS+GOS对小鼠脾淋巴细胞Th1型细胞因子IFN-γ以及Th2型细胞因子IL-4分泌量的影响,实验结果如图3。由图3可见,与阴性对照组相比:GOS处理组和FOS+GOS处理组的细胞上清液中IFN-γ分泌量均显著升高,分别为(131.42±6.47)pg/mL和(126.78±5.97)pg/mL,但两组间差异不显著(P>0.05);而FOS处理组细胞上清液中IFN-γ分泌量【(116.16±1.90)pg/mL】未发生显著变化(P>0.05)。与阴性对照组相比:FOS处理组和GOS处理组的细胞上清液中IL-4分泌量均显著降低,分别为(65.28±0.88)pg/mL和(64.07±3.21)pg/mL,但两组间差异不显著(P>0.05);与阴性对照组相比,FOS+GOS处理组细胞上清液中IL-4分泌量【(60.20±2.04)pg/mL】下降最显著(P<0.05)。

2.4 不同低聚糖对小鼠脾淋巴细胞Th1、Th2型细胞因子mRNA表达量的影响

2.1至2.3中结果表明,FOS对小鼠脾淋巴细胞增殖、IFN-γ分泌及IL-4分泌的调节作用均显著低于GOS和FOS+GOS,因此后续主要采用GOS、FOS+GOS作为研究对象。

2.4.1 低聚糖对小鼠脾淋巴细胞Th1型细胞因子mRNA表达量的影响

小鼠脾淋巴细胞Th1相关细胞因子(IL-2和IFN-γ)mRNA表达量的影响,实验结果如图4。图4表明,与阴性对照组相比,阳性对照组(添加ConA)的IL-2和IFN-γ的mRNA表达量均显著上升(P<0.05)。与阳性处理组相比,GOS处理组和FOS+GOS处理组的IL-2和IFN-γ的mRNA表达量均显著提高(P<0.05),其中GOS处理组的IL-2和IFN-γ的mRNA表达量显著高于FOS+GOS处理组(P<0.05)。

2.4.2 低聚糖对小鼠脾淋巴细胞Th2型细胞因子mRNA表达量的影响

低聚糖对小鼠脾淋巴细胞Th2相关细胞因子(IL-5)mRNA表达量的影响,实验结果如图5。由图5可见,与阴性对照组相比,阳性对照组(添加ConA)的IL-5 mRNA表达量显著下降(P<0.05)。与阳性处理组相比,GOS处理组和FOS+GOS处理组的IL-5 mRNA表达量均显著下降(P<0.05),但二者间差异不显著(P>0.05)。

2.5 不同低聚糖对小鼠脾淋巴细胞Th1、Th2转录因子mRNA表达水平的影响

GATA-3是一种细胞谱系特异性因子,可选择性表达和激活Th2细胞,是唯一控制所有关键Th2型细胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)合成的因子[27]。而T-bet是Th1细胞分化的必需转录因子,其表达在T细胞激活过程中强烈依赖于IFN-γ,能直接诱导Th1细胞的产生,并通过影响GATA-3间接抑制Th2细胞[28]。因此,GATA-3和T-bet对细胞分化和调控至关重要,T-bet和GATA-3的比值被视为反映Th1/Th2平衡的重要指标。

2.5.1 低聚糖对小鼠脾淋巴细胞T-bet和GATA-3 mRNA表达水平的影响

低聚糖对T-bet及GATA-3 mRNA表达水平的影响,实验结果如图6。图6表明,与阴性对照组相比,阳性对照组(添加ConA)的T-bet mRNA表达水平显著上升(P<0.05)。与阳性处理组相比,GOS处理组和FOS+GOS处理组的T-bet mRNA表达水平均显著上升(P<0.05),但二者差异不显著(P>0.05)。与阴性对照组相比,阳性对照组的GATA-3 mRNA表达水平显著下降(P<0.05)。与阳性处理组相比,GOS处理组和FOS+GOS处理组的 GATA-3 mRNA表达水平均显著下降(P<0.05),但二者差异不显著(P>0.05)。

2.5.2 低聚糖对小鼠脾淋巴细胞T-bet与GATA-3比值的影响

低聚糖对小鼠脾淋巴细胞T-bet与GATA-3比值的影响,实验结果如图7。由图7可见,与阴性对照组相比,阳性对照组(添加ConA)的T-bet与GATA-3的比值显著上升(P<0.05)。与阳性处理组相比,GOS处理组和FOS+GOS处理组的T-bet与GATA-3比值显著上升(P<0.05),但二者差异不显著(P>0.05),说明GOS单独处理和FOS+GOS处理均对Th1/Th2平衡具有潜在的调节作用。

3 讨 论

膳食中的益生元如低聚糖,已被证明可通过调节肠道微生物群对免疫系统产生影响[29-31]。近来的研究表明,益生元可以不通过肠道益生菌做媒介,直接对免疫系统产生正向影响。Wongkrasant等[32]以T84细胞作为肠上皮细胞模型,发现FOS通过钙敏感受体(CaSR)-磷脂酶C(PLC)-Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶-β(CaMKKβ)通路诱导AMP活化蛋白激酶(AMPK)激活,从而激发肠上皮细胞的紧密连接,保障肠道屏障完整性。Yang等[33]用GOS干预小牛原代支气管上皮细胞(PBECs),发现溶血性支原体诱导的IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8的释放显著降低。本研究采用小鼠脾淋巴细胞作为研究对象,发现FOS、GOS、FOS+GOS在一定质量浓度范围内可以促进小鼠脾淋巴细胞的增殖,这与Prasanna Kumar等[34]对洋葱低聚果糖的研究结果一致。另外,ConA与低聚糖共同刺激组的脾淋巴细胞增殖活性低于低聚糖单独处理组,这与刘少芳[35]的研究结果一致。

为探究低聚糖对T细胞分化的影响,进一步分析了小鼠脾淋巴细胞因子的分泌情况,发现FOS对Th1型细胞因子IFN-γ分泌的促进作用显著低于GOS和FOS+GOS,然而Capitán-Canadas等[36]用5 g/L FOS和GOS干预C57BL/6J小鼠脾细胞却出现了IFN-γ分泌抑制的现象,提示不同的处理浓度及小鼠品种可能会导致不同的实验结果。本研究中,FOS+GOS促进了Th1细胞分化,这与Overbeek等[18]发现的FOS+GOS能够与人结肠癌细胞HT-29中Toll样受体9(TLR9)结合,进而促进Th1分化的结果一致。TLR信号传导是先天免疫的核心[37],由多种细胞类型表达,包括大多数免疫细胞和上皮细胞[38-39],He等[37]发现,母乳低聚糖的免疫调节活性可以通过TLR介导;Asakuma等[40]发现,乳糖-N-岩藻五糖Ⅰ提高了TLR4的基因表达;还有研究表明,低聚糖可以模拟免疫细胞中的病原体相关分子模式,作为配体与TLR结合,导致NF-κB或其他转录因子的激活,增加细胞因子的分泌并激活发挥免疫作用的基因[41]。然而,Capitán-Canadas等[36]却发现,低聚糖对TLR4基因敲除小鼠脾脏Th1细胞因子TNF-α的促进作用显著低于野生小鼠,而低聚糖对Th1细胞因子IFN-γ的抑制作用在两组小鼠之间差异却不显著,说明低聚糖与TLR的相互作用只对特定的细胞因子有影响。值得注意的是,该研究在对TNF-α和IFN-γ的检测前分别采用脂多糖和ConA刺激脾细胞增殖,推测不同有丝分裂原可能会影响低聚糖与TLR的互作。因此,关于低聚糖在体外对免疫细胞的影响机制还有待深入探究。

本研究发现,GOS与FOS+GOS对小鼠脾淋巴细胞转录因子T-bet和GATA-3比值的影响无显著差异,这与GOS与FOS+GOS处理对细胞因子IFN-γ和IL-4 mRNA表达量影响的检测结果一致;但GOS组的IFN-γ mRNA表示水平显著高于FOS+GOS组,说明IFN-γ的转录和翻译之间有其他因素的介入,如蛋白质的转录后加工与修饰以及mRNA的降解等。但由于细胞因子是调控Th1/Th2平衡的关键因素,因此认为GOS与FOS+GOS对调节Th1/Th2平衡的效果无明显差异。

4 结 论

低聚糖对小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响与其添加浓度相关,呈现浓度依赖性。GOS及FOS+GOS均能抑制Th细胞向Th2型分化,而对Th1型细胞因子的产生有较强的促进作用。GOS和FOS+GOS均能显著上调转录因子T-bet和GATA-3的比值,说明二者均具有调节Th1/Th2平衡进而抗过敏的潜在作用。本研究旨在为低聚糖作为免疫调节原料用于精准营养控制提供科学依据。

参考文献：

[1] IBRAHIM O. Functional oligo-saccharides: chemicals structure, manufacturing, health benefits, applications and regulations[J]. Journal of Food Chemistry and Nanotechnology, 2018, 4(4):65-76.

[2] TOMOMASTU H. Health effects of oligosaccharides[J]. Food Technology, 1994, 48(10):61-65.

[3] FANARO S, MARTEN B, BAGNA R, et al. Galacto-oligosaccharides are bifidogenic and safe at weaning: a double-blind randomized multicenter study[J]. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition,2009,48(1):82-88.

[4] DAI Z Q, FENG S M, LIU A, et al. Anti-inflammatory effects of newly synthesized α-galacto-oligosaccharides on dextran sulfate sodium-induced colitis in C57BL/6J mice[J]. Food Research International, 2018, 109:350-357.

[5] BOUCHAUD G, CASTAN L, CHESNE J, et al. Maternal exposure to GOS/inulin mixture prevents food allergies and promotes tolerance in offspring in mice[J]. Allergy, 2016, 71(1):68-76.

[6] SCHORSCH J, CASTRO C C, COUTO L D, et al. Optimal control for fermentative production of fructo-oligosaccharides in fed-batch bioreactor[J]. Journal of Process Control, 2019, 78(1):124-138.

[7] KAPIKI A, COSTALOS C, OIKONOMIDOU C, et al. The effect of a fructo-oligosaccharide supplemented for-mula on gut flora of preterm infants[J]. Early Human Development, 2007, 83(5):335-339.

[8] FLORES-MALTOS D A, MUSSATTO S I, CONTRERAS-ESQUIVEL J C, et al. Biotechnological production and application of fructooligosaccharides[J]. Critical Reviews in Biotechnology,2016,36(2):259-267.

[9] DAGUET D, PINHEIROI, VERHELSTA, et al. Arabinogalactan and fructooligosaccharides improve the gut barrier function in distinct areas of the colon in the simulator of the human intestinal microbial ecosystem[J]. Journal of Functional Foods,2016,20:369-379.

[10] 陈又铭,李宁,袁卫涛,等.低聚果糖的功能性质及其在食品中的应用[J].中国食品添加剂,2022, 33(1):11-15.
CHEN Y M, LI N, YUAN W T, et al. Functional pro-perties of fructooligosaccharide and its application in food[J]. Chinese Food Additives,2022, 33(1):11-15.

[11] DOMINGUEZ A L, RODRIGUES, L R, LIMA N M, et al. An overview of the recent developments on fructooligosaccharide production and applications[J]. Food and Bioprocess Technology, 2014, 7(2):324-337.

[12] ZHANG B, LI L Q, LIU F T, et al. Human milk oligosaccharides and infant gut microbiota: molecular structures, utilization strategies and immune function[J]. Carbohydrate Polymers, 2022, 276:118738.

[13] 王炜宏, 杨新球. 低聚果糖与低聚半乳糖在婴幼儿配方乳粉中的精准化应用[J]. 中国乳业, 2021(7):102-108.
WANG W H, YANG X Q. Precise application of oligosaccharide and galactose oligosaccharide in infant formula milk powder[J]. China’s Dairy Industry, 2021(7):102-108.

[14] BOEHM G, LIDESTRI M, CASETTA P, et al. Supplementation of a bovine milk formula with an oligosaccharide mixture increases counts of faecal bifidobacteria in preterm infants[J]. Archives of Disease in Childhood-Fetal and Neonatal Edition, 2002, 86(3):178-181.

[15] MORO G, MINOLI I, MOSCA M, et al. Dosage-related bifidogenic effects of galacto- and fructooligosaccharides in formula-fed term infants[J]. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 2002, 34(3):291-295.

[16] EULER A R, MITCHELL D K, KLINE R, et al. Prebio-tic effect of fructo-oligosaccharide supplemented term infant formula at two concentrations compared with unsupplemented formula and human milk[J]. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 2005, 40(2):157-164.

[17] KNOL J, SCHOLTENS P, KAFKA C, et al. Colon microflora in infants fed formula with galacto- and fructo-oligosaccharides: more like breast-fed infants[J]. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 2005, 40(1):36-42.

[18] OVERBEEK S A, VERHEIJDEN K A T, KRANEVELD A D, et al.Non-digestible oligosaccharides scGOS/lcFOS combined with TLR9 ligand induces a Th1 and regulatory T response in an in vitro co-culture model[J]. PharmaNutrition, 2014, 2(3):102-103.

[19] BOEHM G, STAHL B, JELINEK J, et al. Prebiotic carbohydrates in human milk and formulas[J]. Acta Paediatrica, 2007, 94(s449):18-21

[20] ASHSOLU T J. Immune boosting functional foods and their mechanisms: a critical evaluation of probiotics and prebiotics[J]. Biomedicine &Pharmacotherapy, 2020, 130(4):110625.

[21] PERDIJK O, van BAARLEN P, FERNANDEZ-GUTIERREZ M M, et al. Sialyllactose and galactooligosaccharides promote epithelial barrier functioning and distinctly modulate microbiota composition and short chain fatty acid production in vitro[J].Frontiers in Immunology, 2019, 10:00094.

[22] 姜洪池,周孟华.脾脏外科临床研究进展与展望[J]. 中国实用外科杂志,2020,40(1):53-57.
JIANG H C, ZHOU M H. Progress and prospect of clinical research in splenic surgery[J]. Chinese Journal of Practical Surgery, 2020, 40(1):53-57.

[23] LOO T T, GAO Y Y, LAZAREVIC V. Transcriptional regulation of CD4+ Th cells that mediate tissue inflammation[J]. Journal of Leukocyte Biology: An Official Publication of the Reticuloendothelial Society, 2018, 104(6):1069-1085.

[24] QUAN S H, ZHANG Y L, HAN D H, et al. Contribution of interleukin 17A to the development and regulation of allergic inflammation in a murine allergic rhinitis model[J]. Annals of Allergy, Asthma, and Immunology, 2012, 108(5):342-350.

[25] 白梦天,胡竹林.过敏性疾病小鼠动物模型建立及表型变化的研究进展[J].中国比较医学杂志, 2020, 30(2):128-134.
BAI M T, HU Z L. Development of animal models and phenotypic changes of allergic diseases in mice[J]. Chinese Journal of Comparative Medicine, 2020, 30(2):128-134.

[26] SACCHI C N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction[J]. Analytical Biochemistry, 1987, 162(1):156-159.

[27] HO I C, TAI T S, PAI S Y. GATA3 and the T-cell lineage: essential functions before and after T-helper-2-cell differentiation[J]. Nature Reviews Immunology,2009,9(2):125-135.

[28] SINGH R, MIAO T, SYMONDS A L J, et al. Egr2 and 3 inhibit T-bet-mediated IFN-γ production in T cells[J]. The Journal of Immunology, 2017, 198(11):4394-4402.

[29] SINGH R P, NIHARIKA J, KONDEPUDI K K, et al.Recent understanding of human milk oligosaccharides in establishing infant gut microbiome and roles in immune system[J]. Food Research International, 2022, 151:110884.

[30] ZHANG N, JIN M L, WANG K M, et al. Functional oligosaccharide fermentation in the gut: improving intestinal health and its determinant factors: a review[J]. Carbohydrate Polymers, 2022, 284:119043.

[31] ZHAO S, PENG X, ZHOU Q Y, et al. Bacillus coagulans 13002 and fructo-oligosaccharides improve the immunity of mice with immunosuppression induced by cyclophosphamide through modulating intestinal-derived and fecal microbiota[J]. Food Research International, 2020, 140:109793.

[32] WONGKRASANT P, PONGKORPSAKOL P, ARIYADAMRONGKWAN J, et al. A prebiotic fructo-oligosaccharide promotes tight junction assembly in intestinal epithelial cells via an AMPK-dependent pathway[J]. Biomedicine &Pharmacotherapy, 2020, 129:110415.

[33] YANG C A, GILBERT M S, GERRITS W J J, et al. Galacto-oligosaccharides alleviate lung inflammation by inhibiting NLRP3 inflammasome activation in vivo and in vitro[J]. Journal of Advanced Research, 2021, 39:305-318.

[34] PRASANNA KUMAR V, HARISH PRASHANTH K V, VENKATESH V P. Structural analyses and immunomodulatory properties of fructo-oligosaccharides from onion (Allium cepa)[J]. Carbohydrate Polymers, 2015, 117:115-122.

[35] 刘少芳. 牛蒡低聚果糖对小鼠的免疫调控及抗肿瘤作用的研究[D].济南: 山东大学,2007.
LIU S F. Study on immune regulation and antitumor effect of burdock oligosaccharide in mice[D]. Jinan: Shandong University, 2007.

[36] CAPITN-CANADAS F, ORTEGA-GONZLEZ M, GUADIX E, et al. Prebiotic oligosaccharides directly modulate proinflammatory cytokine production in monocytes via activation of TLR4[J]. Molecular Nutrition and Food Research, 2014, 58(5):1098-1110.

[37] HE Y Y, LAWLOR N T, NEUBURG D S.Human milk components modulate Toll-like receptor-mediated inflammation[J]. Advances in Nutrition, 2016, 7(1):102-111.

[38] ABREU M T. Toll-like receptor signalling in the intestinal epithelium: how bacterial recognition shapes intestinal function[J]. Nature Reviews Immunology, 2010, 10(2):131-144.

[39] FIGUEROA-LOZANO S, VALK-WEEBER R V, van LEEUWEN S S, et al. Dietary n-glycans from bovine lactoferrin and TLR modulation[J]. Molecular Nutrition &Food Research, 2018, 62(2):1700389.

[40] ASAKUMA S, YOKOYAMA T, KAZUMASA K, et al. Effect of human milk oligosaccharides on messenger ribonucleic acid expression of Toll-like receptor 2 and 4, and of MD2 in the intestinal cell line HT-29[J].The Japanese Society of Applied Glycoscience, 2010, 57(3):177-183.

[41] PEAHEV D, van DEN ENDE W. Fructans: prebiotics and immunomodulators[J]. Journal of Functional Foods, 2014, 8:348-357.

Immunomodulatory Effects of Oligosaccharides on Splenic
Lymphocytes in Mice

LIU Xiaohan1, LI Tiange2, GAO Jingxin1, MAO Xueying1,*

(1.College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University/Key Laboratory of Functional Dairy of Ministry of Education, Beijing 100083, China;2.College of Food Science and Technology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

Abstract：The aim of the present study was to investigate the effects of fructo-oligosaccharides (FOS), galacto-oligosaccharide (GOS), and the mixture of FOS and GOS (FOS+GOS) on the proliferation of splenic lymphocytes, as well as the regulation of Th cell differentiation and Th1/Th2 balance. Spleen lymphocytes of mice were incubated with FOS. GOS and FOS+GOS mixture, respectively, with or without Concanavalin A (ConA) stimulation. Spleen lymphocyte proliferation level wasdetected by MTT colorimetric assay. To explore the differentiation direction of Th cell, the expression ofThl and Th2 cytokines and the transcription factors T-bet and GATA-3 were determined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and PCR, respectively. The results showed that the proliferative activities of FOS, GOS and FOS+GOS mixture on mouse splenic lymphocytes were concentration-dependent, and all of them exhibited promoting splenic cell proliferation activity at the concentration of 125 μg/mL, with FOS+GOS mixture having the strongest promotion effect on splenic cell proliferation. There was no significant difference among them on the splenic cell proliferation activity under ConA stimulation. FOS+GOS mixture had the strongest effect on the splenic cell proliferation activity without ConA stimulation. The supplementation of GOS and FOS+GOS mixture increased the secretion of Th1-type cytokine IFN-γ and the mRNA expression levels of IFN-γ and IL-2, and inhibited the expression and secretion levels of Th2-type cytokine-related mRNA including IL-4 and IL-5. In conclusion, both FOS+GOS mixture and GOS possess immunoregulatory activity and regulate Th1/Th2 balance, which deserve them as potential anti-allergic ingredients.

Keywords：oligosaccharide; splenic lymphocytes; immune regulation; Th1/Th2 balance; cytokine

doi：10.12301/spxb202201083

文章编号：2095-6002(2024)06-0045-09

引用格式：刘笑含,李天歌,高婧昕,等.低聚糖对小鼠脾淋巴细胞免疫平衡的调节作用[J]. 食品科学技术学报,2024,42(6):45-53.

LIU Xiaohan,LI Tiange,GAO Jingxin, et al. Immunomodulatory effects of oligosaccharides on splenic lymphocytes in mice[J]. Journal of Food Science and Technology, 2024,42(6):45-53.

中图分类号：TS201.4

文献标志码：A

收稿日期：2023-05-12 修回日期: 2024-01-02

基金项目：国家重点研发计划项目(2023YFF1104502);“十三五”国家重点研发计划专项(2019YFC1605000);家畜产业技术体系北京市创新团队项目(BAIC05-2024)。

Foundation： National Key Research and Development Program of China(2023YFF1104502); The 13th Five-Year Plan National Key Research and Development Program of China (2019YFC1605000); Beijing Livestock Industry Innovation Team (BAIC05-2024).

第一作者：刘笑含,女,硕士研究生,研究方向为功能乳品。

*通信作者：毛学英,女,教授,博士,博士生导师,主要从事功能乳品方面的研究。

(责任编辑：叶红波)