DOI:10.12301/spxb202300160
中图分类号:TS201.3
高降尿酸活性乳酸菌的筛选及其作用机制
李婧， 姚彩青， 王俊国
| 【作者机构】 | 内蒙古农业大学食品科学与工程学院/乳品生物技术与工程教育部重点实验室/农业农村部奶制品加工重点实验室 |
| 【分 类 号】 | TS201.3 |
| 【基 金】 | 国家自然科学基金资助项目(31660456) 内蒙古自然科学基金重点项目(2018ZD14)。 Foundation： National Natural Science Foundation of China (31660456) Major Program of Natural Science Foundation of Inner Mongolia (2018ZD14). |
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高降尿酸活性乳酸菌的筛选及其作用机制
近年来,随着人们生活水平的提高,高尿酸血症发病者逐年增加[1-2],探寻高效低毒的高尿酸血症治疗方法已成为近年来的研究热点。
肠道中尿酸生成量与黄嘌呤氧化酶(XOD)的表达量密切相关。当富含嘌呤的食物进入体内参与代谢时,其核酸氧化分解为嘌呤,之后利用XOD将嘌呤氧化为尿酸[3-4]。人体内的尿酸约2/3由肾脏排出,1/3由肠道排出体外。在改善高尿酸血症的过程中,肠道菌群中某些特定菌种能够影响尿酸的代谢,进而能够减少体内血尿酸累积[5-6]。而益生菌对尿酸代谢和排泄的调节同样是非常有效的[7],目前发现乳酸菌是改善高尿酸血症的主要益生菌种类[8]。
乳酸菌在高尿酸血症辅助治疗方向上拥有药物治疗无可比拟的优点,无药物不良反应、几乎不需要限制饮食、患者依从度高[9]。乳酸菌降尿酸主要通过2种方式。一种是减少嘌呤、核苷等原料的肠道吸收量抑制尿酸的生成。Yamada等[10]发现了在体外可以吸收鸟苷酸和鸟苷的Lactobacillus gasseri PA-3,灌胃大鼠后能够减少血液中鸟苷酸和鸟苷的含量,抑制这些嘌呤在大鼠肠道中的吸收。另一种是对已经形成的尿酸进行分解。Cao等[11-12]研究表明,Lacticaseibacillus paracasei X11及Lactiplantibacillus plantarum Q7在体外具有优异的尿酸降低活性。在研究乳酸菌降尿酸机制方面,大部分研究认为乳杆菌属可以分泌尿酸降解酶(尿酸氧化酶、尿囊素酶),这些酶有助于将尿酸降解为尿素,促进尿酸分解进而降低尿酸水平[13]。Handayani等[14]筛选了13株胞外和胞内产尿酸氧化酶的乳酸菌,表明所有菌株均能产生尿酸氧化酶来分解尿酸。目前关于通过减少嘌呤核苷等抑制尿酸生成的相关机制研究较多,但对乳酸菌分解已形成尿酸机制的研究较少。
为探究乳杆菌降尿酸的作用机理,本研究拟采用高效液相色谱(HPLC)法体外筛选出降尿酸作用强的乳杆菌,对其死菌、活菌、细胞破碎液降尿酸的效果进行评价,并对不同细胞成分在降尿酸过程中起到的作用进行测定,以确定影响乳杆菌降尿酸的主要细胞成分。研究旨在筛选获得具有潜在降尿酸作用的天然来源的乳酸菌,为乳酸菌改善高尿酸血症提供一种新途径。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB),分离自内蒙古呼伦贝尔传统发酵乳,由内蒙古农业大学食品科学与工程学院乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供。具体乳酸菌信息见表1。
表1 实验乳酸菌信息
Tab.1 Laboratory lactic acid bacteria information
菌种名称菌株名称来源Streptococcus thermophilusST0酸牛奶Streptococcus thermophilusLM-4酸牛奶Lactobacillus helveticusLH3酸驼奶Lactobacillus helveticusM2-1酸马奶Lactobacillus helveticusM1-2酸马奶Lactobacillus helveticusM1-1酸马奶Lactobacillus helveticusT1(1)-1酸驼奶Lactobacillus helveticusT1(2)-1酸驼奶Lactiplantibacillus plantarumHN2-7酸牛奶Lactiplantibacillus plantarumHN2-3酸牛奶Lactiplantibacillus plantarumHN2-5酸牛奶Lactiplantibacillus plantarumN2-4酸牛奶Lacticaseibacillus rhamnosusN1-2酸牛奶Lacticaseibacillus rhamnosusN1-4酸牛奶Lacticaseibacillus rhamnosusN1-5酸牛奶Lacticaseibacillus paracaseiM2-4酸马奶Lacticaseibacillus paracaseiLP4酸马奶Lactococcus lactisHN2-4酸牛奶Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricusLD1酸牛奶Lactobacillus kefiranofaciensN3-4酸牛奶
尿酸(色谱纯),北京索莱宝试剂公司;甲醇(色谱纯),赛默飞世尔科技(中国)有限公司;高氯酸(优级纯)、H3PO4(优级纯),Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司;磷酸钾(优级纯),上海麦克林生化科技有限公司;M17培养基、MRS培养基,青岛海博生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
1214B型超净台,上海智城分析仪器制造有限公司;DHP-9272型恒温培养箱,上海恒科技有限公司;VCX750型超声波细胞破碎仪,美国Sonics公司;1260 Infinity II型高效液相色谱仪,安捷伦科技(中国)有限公司;Hitachi Regulus8100型扫描电子显微镜,Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌株活化
将菌株从-80 ℃超低温冰箱中取出,按照质量分数2%的接种量活化培养,球菌接种于M17液体培养基,其他乳杆菌接种于MRS液体培养基中,于42 ℃或37 ℃,培养18 h,活化至三代备用。
1.3.2 降尿酸乳酸菌的筛选
0.16 mmol/L的尿酸标准品溶解于10 mmol/L K3PO4溶液(H3PO4调pH值至7.0)中制成尿酸标准溶液。取0.9 mL尿酸标准溶液加入0.1 mL的终止剂溶液(0.1 mol/L高氯酸),经0.22 μm滤膜过滤后,吸取5 μL滤液进行HPLC检测,外标法测定尿酸保留时间并制作定量标准曲线。HPLC 条件:Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm×4.0 μm),流动相为KH2PO4-甲醇(体积比96∶4)混合,流速0.4 mL/min,柱温30 ℃,检测波长254 nm,时间15 min。
将菌液4 000 r/min离心10 min,弃上清,清洗菌体,调节菌体浓度至108 CFU/mL。取2 mL菌液4 ℃、4 000 r/min离心10 min收集菌体,加入0.75 mL的尿酸标准溶液,37 ℃培养60 min。4 ℃、4 000 r/min离心10 min后取上清液加入终止剂高氯酸溶液,经0.22 μm滤膜过滤后用于HPLC分析。根据HPLC分析和标准曲线确定各乳酸菌尿酸降低率,见式(1)。
尿酸降低率
(1)
式(1)中,c0为尿酸标准溶液浓度,mmol/L;c1为样品尿酸浓度,mmol/L。
1.3.3 死菌及死、活菌破碎液的降尿酸活性测定
4 000 r/min离心10 min,弃上清液,用无菌生理盐水清洗菌体2次,加入PBS缓冲液调节菌体浓度至108 CFU/mL后,将菌液分成2份,其中一份按1.3.2节方法加入尿酸标准溶液培养后用于HPLC分析;另一份将菌121 ℃、20 min热致死后,按1.3.2节方法加入尿酸标准溶液培养后用于HPLC分析。按照相同方法制备菌液后,将活菌完整菌体进行超声破碎(功率200 W,工作时间5 s,停顿时间5 s,总时间6 min)制备活菌破碎液。将菌121 ℃、20 min热致死后,依照活菌破碎液制备方法制备死菌破碎液。分别取0.45 mL乳酸菌破碎液加入0.45 mL尿酸标准溶液,37 ℃培养60 min,加入0.1 mol/L高氯酸溶液终止反应进行HPLC分析。
1.3.4 细胞壁对尿酸的吸附作用测定
根据Zou等[15]方法并稍加修改。将菌液4 000 r/min离心10 min,弃上清液收集菌体,洗菌2次。加入PBS缓冲液悬浮,调节菌体浓度至108 CFU/mL后进行超声破碎。取破碎后的菌液在4 ℃、12 000 r/min下离心10 min,弃上清液,收集沉淀即为菌株的细胞壁。将菌株热致死后提取死菌细胞壁。PBS清洗细胞壁后,加0.75 mL的尿酸标准溶液,37 ℃培养60 min,离心后取上清液加入终止剂高氯酸溶液。经0.22 μm滤膜过滤后进行HPLC分析。
1.3.5 胞外物和胞内物的降尿酸活性测定
按1.3.2节方法收集菌体,37 ℃培养30 min,离心后取0.45 mL上清液(胞外物)加入0.45 mL尿酸标准溶液,再次放入培养箱37 ℃培养30 min,加入0.1 mL高氯酸溶液终止反应,0.22 μm滤膜过滤后进行HPLC分析。菌体重悬于10 mmol/L PBS中,超声破碎(功率200 W,工作时间5 s,停顿时间5 s,总时间6 min)。破碎后的菌液在4 ℃、12 000 r/min下离心10 min,取0.45 mL上清液(胞内物)加入0.45 mL尿酸标准溶液,再次放入培养箱37 ℃培养60 min,加入0.1 mL高氯酸溶液(0.1 mol/L),0.22 μm无菌膜过滤后进行HPLC分析。
死菌胞外物和胞内物降尿酸活性测定根据金方等[16]的方法并稍加修改。将菌液4 000 r/min离心10 min,弃上清液收集菌体,洗菌后加入10 mmol/L PBS悬浮菌体,调节菌体浓度至108 CFU/mL,经121 ℃、 20 min热灭活后,按相同方法测定胞外物及胞内物的降尿酸作用。
1.3.6 胞内酶的降尿酸活性测定
胞内酶测定方式按照Zheng等[17]方法进行。取菌液4 ℃、4 000 r/min离心10 min,弃上清液收集菌体,洗菌后加10 mmol/L PBS悬浮,调节菌体浓度至108 CFU/mL,超声破碎(功率300 W,工作时间 5 s,停顿时间5 s,总时间30 min)。破碎后的菌液在4 ℃、12 000 r/min下离心10 min,取0.45 mL上清液(胞内酶)加入0.45 mL尿酸标准溶液,再次放入培养箱37 ℃培养60 min,加入0.1 mL高氯酸溶液,0.22 μm无菌滤膜过滤后进行HPLC分析。将菌株按照相同方法提取胞内酶,121 ℃、20 min灭活后按照相同方法进行分析。
1.3.7 原生质体对尿酸的吸附作用测定
将培养好的菌液置于冰水浴中30 min,离心后收集沉淀。用0.02 mol/L的 PBS(pH值为7.0)洗涤2次,调节菌体浓度至108 CFU/mL,再次离心后将菌体加入TMS缓冲溶液(含0.01 mol/L Tris-HCl、0.02 mol/L MgCl2和0.5 mol/L蔗糖的混合溶液)中,并加入溶菌酶后在37 ℃的条件下培养2 h后,4 000 r/min,离心10 min ,清洗后重新悬浮于TMS中即可得到原生质体[18]。死菌原生质体按照1.3.3节方法热处理乳杆菌后制备。取制备好的原生质体加入尿酸标准溶液后培养用于HPLC分析。
1.3.8 乳酸菌微观形态观察
按照1.3.7节的方法得到吸附前后的乳酸菌样品。收集菌体后悬浮于质量分数2.5%的戊二醛中,固定过夜,之后离心收集菌体,并用0.1 mol/L的PBS缓冲液(pH值为 7.0)漂洗样品3次,分别使用体积分数50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇进行脱水处理,每次15 min,之后加入乙酸异戊酯置换乙醇,重复2次,每次20 min。冷冻干燥后用于扫描电镜观察乳酸菌微观形态。
1.4 数据处理
结果以平均值±标准偏差(SD)表示,每个实验包含3次重复。为了确定平均值差异的显著性,数据使用SPSS 20.0进行分析。P<0.05表示平均值差异有统计学意义。绘图采用Origin 2017。
2 结果与分析
2.1 不同乳酸菌的降尿酸作用分析
不同乳酸菌体外降尿酸作用见图1。20株乳酸菌中对尿酸的降低率较高的有L. rhamnosus N1-2、L. rhamnosus N1-5、L.helveticus LH3、L. helveticus T1(1)-1、L.paracasei LP4,尿酸分别降低了41.96%、42.50%、44.18%、46.22%、37.33%。考虑到不同乳酸菌对尿酸降低作用的特异性,选择这5株乳杆菌作为接下来的研究对象。
不同大写字母表示乳酸菌降尿酸作用差异显著(P<0.05)。
图1 不同乳酸菌的体外降尿酸作用
Fig.1 Uric acid lowering effect of different LAB in vitro
2.2 乳杆菌体外降尿酸作用机制分析
2.2.1 5株乳杆菌死、活菌及其破碎液的降尿酸作用分析
死、活菌及其破碎液的降尿酸作用见图2。由图2可知,5株热致死后的乳杆菌降尿酸作用显著低于活菌菌体(P<0.05),但是依旧具有一定的降低作用。这表明乳杆菌降尿酸不一定完全依赖尿酸降解酶的作用,可能其他细胞成分也起到了一定的作用。因此下一步对活、死菌的细胞破碎液降尿酸作用进行了测定,5株菌的活、死菌破碎液对尿酸的降低作用无显著性差异(P>0.05),但显著高于活、死菌的作用(P<0.05)。这一结果说明5株菌降尿酸的作用与尿酸降解酶似乎没有关联性,可能是细胞破碎液中含有的其他物质对尿酸有去除作用,这些物质可能是菌体细胞壁[17]、细胞膜[19]或由于胞内物所含蛋白质等物质[20]的吸附作用。因此,进一步对乳杆菌的不同成分进行研究。
不同小写字母表示同一乳杆菌的死菌、活菌、死菌破碎液、活菌破碎液的降尿酸作用差异显著(P<0.05)。
图2 死、活菌及其破碎液的降尿酸作用
Fig.2 Uric acid lowering effect of dead and living bacteria and their broken liquor
2.2.2 5株乳杆菌细胞壁对尿酸的吸附作用分析
热致死菌株对尿酸的作用效果可能是由于乳杆菌的表面吸附作用。为了确定乳杆菌降尿酸的具体作用机制,首先测定了5株乳杆菌活菌及死菌细胞壁对尿酸的吸附作用,结果见图3。由图3可知,乳杆菌N1-2、N1-5、LH3、T1(1)-1、LP4的活菌及死菌的细胞壁对尿酸的去除作用均远低于完整菌体的降尿酸作用(P<0.05)。实验结果表明,尽管细胞壁对尿酸有一定程度的吸附作用,但这并不是5株菌能降低尿酸含量的主要原因。
不同小写字母表示同一乳杆菌活菌、活菌细胞壁及死菌细胞壁尿酸吸附作用差异显著(P<0.05)。
图3 死、活菌细胞壁对尿酸的吸附作用
Fig.3 Adsorption effect of uric acid by cell wall of dead and living bacteria
2.2.3 5株乳杆菌胞外物和胞内物的降尿酸作用分析
细菌胞外分泌物主要有酶类、蛋白质、多糖及脂类等物质[21],而细菌胞内物是指细胞壁内的一些物质,包括多肽、蛋白质及胞内酶等物质。为了进一步探究乳杆菌降尿酸的作用机制,本研究测定了5株乳杆菌胞外物和胞内物对尿酸的降低作用,结果见图4。由图4可知,5株乳杆菌死菌和活菌的胞外提取物对尿酸的降低作用均显著低于胞内物(P<0.05),表明胞外物不是降尿酸的主要因素;而5株乳杆菌胞内提取物表现出较强的降尿酸作用,且5株菌致死后的胞内物降尿酸作用与活菌胞内物无显著性差异(P>0.05),这进一步证实5株菌降尿酸作用可能与尿酸降解酶的活性无关。
不同大写字母表示同一乳杆菌不同物质降尿酸作用差异显著(P<0.05);不同小写字母表示不同乳杆菌相同物质降尿酸作用差异显著(P<0.05)。
图4 死、活菌胞外物和胞内物的降尿酸作用
Fig.4 Uric acid lowering effect of extracellular and intracellular substances of dead and living bacteria
2.2.4 5株乳杆菌胞内酶的降尿酸作用分析
微生物在生命活动过程中会产生多种酶,在胞内起作用的酶具有许多独特的物理化学性质,酶活性高且稳定,具有非常重要的潜在用途[22]。目前已有研究表明,乳杆菌可通过胞内尿酸氧化酶的作用来分解尿酸[14],而2.2.2节和2.2.3节结果也表明了,5株乳杆菌死、活菌的细胞壁和胞外物对尿酸均无显著降解作用,因此为了验证该结果,测定了胞内酶及失活胞内酶的降尿酸效果,结果见图5。由图5可知,5株乳杆菌[N1-2、N1-5、LH3、T1(1)-1、LP4]胞内酶对尿酸有不同程度的降低作用。但是将胞内酶进行灭活处理后,发现其降尿酸作用与未灭活的酶无显著性差异(P>0.05),表明乳杆菌降尿酸作用与胞内酶无关。目前已有研究表明,热灭活后乳酸菌的细胞膜与一些物质结合得更好[23],考虑到提取胞内酶的同时细胞膜的破碎片段也在其中,且死菌破碎液也发挥了一定的降尿酸作用,因此,推测细胞膜的吸附作用可能是尿酸减少的主要原因,但如何分离细胞膜是需要解决的一个难题。
相同小写字母表示同一乳杆菌灭活前后胞内酶降尿酸作用差异不显著(P>0.05)。
图5 乳杆菌胞内酶的降尿酸作用
Fig.5 Uric acid lowering effect of intracellular enzymes in lactobacillus
2.2.5 5株乳杆菌原生质体对尿酸的吸附作用分析
原生质体是细菌通过酶解使细胞壁溶解脱去而得到的具有细胞膜包裹的原生质球状体[24]。完整的原生质体只有细胞膜能够与外界接触,这避免了胞内物与尿酸的接触,目前已有研究使用原生质体实验来突出细胞膜的吸附作用[18]。为进一步验证乳杆菌降尿酸是否通过细胞膜的吸附作用实现,进行了原生质体降尿酸实验,结果见图6。由图6可知,5株乳杆菌[N1-2、N1-5、LH3、T1(1)-1、LP4]原生质体对尿酸有不同程度的吸附作用。致死后5株乳杆菌原生质体的吸附作用较活菌无显著性差异(P>0.05)。结果表明,5株乳杆菌对尿酸的降低作用主要是通过细胞膜的物理吸附作用实现。5株乳杆菌中L. helveticus T1(1)-1、 L. helveticus LH3降尿酸活性高于L. rhamnosus N1-2及L. rhamnosus N1-5,降尿酸作用最低的为L.paracasei LP4,与原生质体对尿酸的吸附率一致,但是不同乳杆菌的吸附作用存在差异,可能是由于不同菌之间存在特异性。
相同小写字母表示同一乳杆菌中死、活菌原生质体降尿酸作用差异不显著(P>0.05)。
图6 乳杆菌原生质体的降尿酸作用
Fig.6 Uric acid lowering effect of protoplasts in lactobacillus
2.3 乳杆菌吸附尿酸形态观察结果
通过电镜分析可验证细胞膜对某种物质的吸附作用[25]。乳杆菌吸附尿酸前后的形态见图7。结果表明,吸附尿酸前活、死菌的菌体形态完整、无破碎[图7(a)、图7(c)];吸附尿酸后,5株乳杆菌的细胞膜表面出现了物质沉积,细胞的形态结构也遭到了破坏,菌体变形、凹陷[图7(b)、图7(d)]。吸附作用最强的LH3细胞表面被严重破坏,菌体出现细胞破损穿洞现象。这可能是因为乳杆菌与尿酸结合在细胞膜表面后,导致细胞暴露于不利的生长环境,发生变形甚至严重的破裂[26]。电镜结果进一步验证了原生质体的实验结果,表明5株乳杆菌的降尿酸作用主要是通过细胞膜的吸附作用实现的。Kimoto等[27]发现死菌的细胞膜可以通过吸附作用去除培养基中的胆固醇。此外,还有研究发现乳酸菌除与细胞壁结合外,还可以与细胞壁内的原生质膜结合,从而导致吸附物质能力增强[28-29]。
图7 乳杆菌死、活菌吸附尿酸前后的扫描电镜结果
Fig.7 Scanning electron microscopy results of dead and living lactobacillus before and after adsorbing uric acid
目前大量研究表明热灭活细菌对一些物质的吸附作用与细胞表面的物理化学性质密切相关,包括比表面积、氮碳比(N/C)、疏水性和官能团[30]。还有研究表明,乳酸菌细胞膜上的甲基、亚甲基、次甲基等基团会参与物质的吸附过程[26]。因此推测可能是细胞膜磷脂结构中的疏水部分或官能团等物质对尿酸的吸附起到了重要作用。考虑到破碎细胞时,细胞膜片段增多,有更多的机会接触到尿酸,这也解释了死、活菌的细胞破碎液比活菌降尿酸作用强的原因。
3 结 论
本研究筛选出了5株降尿酸作用较强的乳杆菌,重点探究了乳杆菌降尿酸的作用机制。发现5株乳杆菌降尿酸作用与菌株是否存活关联性较小。但是细胞破碎液显示出了很好的降尿酸效果,而胞内酶灭活后,乳杆菌依旧表现出较好的降尿酸作用,表明了乳杆菌的降尿酸作用不是通过酶的作用。原生质体和扫描电镜实验发现,5株菌降尿酸主要是通过细胞膜的吸附作用实现。研究结果旨在扩大乳杆菌的应用范畴,不用再局限于要求乳杆菌发挥作用时的活性。未来将继续对乳杆菌细胞膜的何种成分在降尿酸中发挥作用进行深入研究。
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